Extraction and purification of okadaic acid (OA) and dinophysis toxin-1 (DTX1) in the dinoflagellate Protocentrum Lima
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摘要:
批量培养产生腹泻性贝类毒素的利玛原甲藻，甲醇提取超声破碎后的藻细胞；用大孔吸附树脂HP20富集其胞外毒素并进行毒素的初步纯化。经制备型高效液相色谱法分离，分别得到毫克级的大田软海绵酸和鳍藻毒素-1固体。经核磁共振氢谱和高分辨质谱确认结构，定量核磁确定纯度，得到的大田软海绵酸和鳍藻毒素-1纯度分别为99.39%和99.26%，满足标准物质制备要求。
Abstract:Marine dinoflagellate Prorocentrum lima producing diarrhetic shellfish poison were mass cultured and crushed by ultrasonic, followed by extracting with methanol for okadaic acid (OA) and dinophysis toxin-1(DTX1). OA and DTX1 with high purity were obtained by a preparative high performance liquid chromatographic (HPLC) method after enrichment and purification with macroporous adsorption resin HP20, which was used for the enrichment of extracellular toxin secreted in the sea water. The two compounds were identified by nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum (1H-NMR) and high-resolution mass spectrometry (HRMS). The purity of OA and DTX1 was identified by quantitative nuclear magnetic to be 99.39% and 99.26% respectively, meeting the requirements for preparation of standard material.
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Keywords:
- Prorocentrum lima /
- okadaic acid /
- dinophysis toxin-1 /
- Extraction /
- purification
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利玛原甲藻（Prorocentrum lima）是一种产生腹泻性贝类毒素（diarrhetic shellfish poisoning, DSP）的海洋底栖甲藻，常附着于大型海藻、珊瑚礁、海草及海底沙粒上，主要栖息于温带、亚热带和热带海域[1]，广泛分布于世界近海。利玛原甲藻可产生的毒素有大田软海绵酸（okadaic acid, OA）和鳍藻毒素（dinophysis toxins, DTXs，包括DTX1-4，DTX5a,b,c）及其他衍生物（Acyl-OA，19-epi-OA，DTX1 methyl ester等）[2-6]。其胞内毒素可用甲醇[4]、甲醇-水[7]、tris-HCl-甲醇[8]以及甲醇-乙醚[9]等提取，胞外毒素可使用大孔吸附树脂（如HP20）富集，经有机溶剂洗脱后，可获得一定数量的毒素粗提物。
大田软海绵酸(OA)及其衍生物鳍藻毒素-1(DTX1)是腹泻性贝类毒素的常见组分，属一类脂溶性多环醚（图1），易溶于甲醇、乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂[10]。对蛋白质磷酯酶有抑制活性，可在贝类等海洋动物体中积累，导致食用者中毒，中毒症状有腹泻、恶心、呕吐及肠胃绞痛等[11-12]。是一种很强的致癌剂，长期接触会促进消化道肿瘤的形成[13]。欧盟规定贝类等海产品中大田软海绵酸（OA）与鳍藻毒素（DTX1/2）的限量标准为二者合计160 µg/kg[14]，我国海产品中腹泻性贝类毒素限量标准为50 MU/kg。
大田软海绵酸（OA）及鳍藻毒素-1（DTX1）的检测方法有小鼠生物法（mouse biological assay, MBA）[11-12]、酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）[15]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[11]和高效液相色谱-质谱联用法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS/MS）[12, 16]。由于小鼠生物法检测结果假阳性严重，国际上已逐渐废除。酶联免疫吸附法和高效液相色谱-质谱联用法为现在最常用的腹泻性贝类毒素检测方法，但这两种方法都需要相应的毒素标准物质。近年来，我国沿岸海域腹泻性贝类毒素时有检出[17-18]，全世界仅有加拿大和西班牙两家公司可提供海洋生物毒素标准物质，供货时间长，价格昂贵，严重制约我国海洋环境及海产品中相关毒素日常检测工作的开展。因此，开展我国腹泻性贝类毒素标准物质的研制十分必要。
本项研究通过批量培养利玛原甲藻，提取纯化其胞内和胞外毒素，得到毫克级高纯度的大田软海绵酸（OA）和鳍藻毒素-1（DTX1），为其标准物质的研制，提供可靠的技术支持。
1 材料与方法
1.1 实验材料
利玛原甲藻来自厦门大学藻种库。使用添加f/2培养基的灭菌海水在实验室连续培养。培养温度（22±1）℃、光照强度4000 lx、光照周期L∶D =12 h∶12 h，30 d左右收获一次[8]。经连续流离心机分离浓缩，藻泥用于胞内毒素的提取；培养液经大孔吸附树脂HP20富集，乙醇洗脱，收集胞外毒素。
1.2 试剂与仪器
试剂：大田软海绵酸（OA）和鳍藻毒素-1（DTX1）标准物质购自加拿大海洋生物研究所；甲醇、乙腈为色谱纯，购自德国默克公司；乙醇、盐酸、乙酸均为分析纯，购自天津市科密欧化学试剂公司；大孔吸附树脂HP20购自日本三菱公司；色谱仪器用水均为蒸馏水，购自屈臣氏公司；0.22 μm孔径滤膜购自上海兴亚净化材料厂。
仪器：高效液相色谱（Ulitimate 3000，Thermo）-三重四级杆质谱（API4000，AB）联用仪；半制备型高效液相色谱仪（Agilent 1260-6120，单四级杆质谱检测器，安捷伦）；制备型高效液相色谱仪（P2100，紫外检测器，辽宁谱道）；旋转蒸发仪（I-300，BUCHI）；冷冻干燥机（Scientz-18N，宁波新芝）；温控型超声波细胞粉碎机（Xinchen）；高速冷冻离心机（2-16KL，Sigma）；制备型反相液相色谱柱（XB-C18，21.2×250 mm，10 µm，上海月旭）；半制备型反相液相色谱柱（Xtimate-C18，10×250 mm，5 µm，上海月旭）；反相液相色谱柱（X-Bridge C18，3.0×150 mm，3.5 µm，waters）。
1.3 实验方法
1.3.1 利玛原甲藻胞内毒素提取
称取4份利玛原甲藻藻泥，每份10 g，分别加入10 mL的甲醇（溶剂A）、0.1 mol/L乙酸+80%甲醇溶液（溶剂B）、H2O+80%甲醇溶液（溶剂C）和1∶2的tris-HCl+甲醇溶液（溶剂D），涡旋混合均匀后超声破碎，功率为20 W，脉冲间歇时间为3 s，破碎时间12 min，使利玛原甲藻细胞壁破裂，藻细胞充分破碎，重复提取3次。10,000 r/min离心后合并收集上清提取液，提取液经HPLC-MS/MS检测OA和DTX1的含量并确定最佳溶剂。用最佳溶剂多次提取藻泥，直至提取液中不再检出OA和DTX1为止。合并全部提取液，浓缩冻干，得到毒素粗提物4 ℃密封保存，待用大孔吸附树脂初步分离。
1.3.2 利玛原甲藻胞外毒素的富集
称取活化后的1 kg大孔吸附树脂HP20装入带有砂板的玻璃层析柱中，树脂稳定后高度为40 cm，体积1.8 L。将利玛原甲藻培养液以2.0 L/h的流速通过大孔吸附树脂HP20。动态吸附结束后，静态吸附过夜，用6倍柱体积的95%乙醇溶液淋洗树脂柱，收集洗脱液，浓缩后用HPLC-MS/MS检测OA和DTX1的含量。
1.3.3 大孔吸附树脂初步分离毒素
1.3.1和1.3.2得到的浓缩液，纯净水稀释定容，以1.0 L/h的流速通过再生的HP20树脂柱。上样结束后，吸附过夜，依次用水、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液淋洗树脂柱，HPLC-MS/MS检测洗脱液毒素组分及含量，收集其中OA和DTX1含量较高的部分，浓缩、冻干后甲醇溶解待制备液相色谱进一步纯化。
1.3.4 高效液相色谱-质谱联用分析方法
高效液相色谱分析条件：色谱柱：X-Bridge C18（150 mm×3.0 mm，3.5 μm）；流动相：A：0.05%的氨水溶液(pH 11)；B：含有0.05%氨水的乙腈-水(90/10，v/v)溶液(pH 11)；流速：0.4 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：10 µL；梯度：0～10 min，B：10%～90%；10~13 min，B：90%。
三重四级杆质谱分析条件：离子源：电喷雾离子源（ESI-）；喷雾电压：4,500 V；毛细管温度：600 ℃；源内碰撞解离电压：5 V；雾化气流速：60 L/min；辅助气流速：50 L/min。扫描模式：负离子全扫描；荷质比：200~1500。选择OA、DTX1及相关衍生物的定性离子确定利玛原甲藻的产毒特征（表1）。
表 1 HPLC-MS/MS检测利玛原甲藻中OA、DTX1及其衍生物的质谱条件Tab. 1 The analysis condition of OA and DTX-1 and its derivatives in Prorocentrum lima c ells by HPLC-MS/MS名称 Q1 Q3 OA 803 255 DTX1 817 577 DTX2 803 577 DTX3 1055 − DTX4 1509 1311.1 DTX5a 1458 937 DTX5b 1472 951 DTX5c 1430 714 Acyl-OA 1041 − 19-epi-OA 803 785 DTX1 methyl ester 831 813 1.3.5 制备型高效液相色谱（preparetion high performance liquid chromatography，PHPLC）分离纯化毒素
首次制备：色谱柱：XB-C18柱（21.2×250 mm，10 µm）；柱温：室温；流动相A：水，流动相B：乙腈；流速：15 mL/min；进样量：10 mL；馏分收集器：3 min/管；梯度：0～40 min，B：20%～80%；40～45 min，B: 80%～100%；45～60 min，B: 100%。
再次制备：色谱柱：Xtimate-C18柱（10×250 mm，5 µm）；柱温：40 ℃；流动相A：0.05%的氨水溶液，流动相B：含有0.05%氨水的乙腈-水(90/10，v/v)溶液；流速：4.0 mL/min；进样量：100 µL；梯度：0~1 min，B：20%；1~15 min，B: 20%~90%；15~17 min；B：90%。
1.3.6 定量核磁检测方法
1.3.6.1 检测条件与仪器
仪器：Bruker AVANCE Ⅲ型400 MHz核磁共振仪(瑞士Bruker公司)；实验材料：一级标准物质苯甲酸（GBW06117）；氘代试剂（氘代甲醇, J&K Co., Ltd）；5 mm核磁管（Wilmad经济型核磁管）。
1.3.6.2 主要实验过程
（1）样品配制方法
分别准确称量约1 mg（精确至0.001 mg）样品和0.4 mg（精确至0.001 mg）内标物苯甲酸各7份置于棕色玻璃瓶，在0.8 mL氘代甲醇中振荡完全溶解后，转移至直径为5 mm的核磁试管中，待测。
（2）核磁数据采集
核磁实验参数中1H NMR测定参数设定包括： 3D匀场（topshim tunea）、自动调谐 (atma)、激发脉冲角度、时间域数据点64K、信号最大的放大倍数（采用自动调节增益rga和手动调节相结合的方式确定：首先采用自动调节增益信号摸索最大的增益，如果发现信号的溢出，需要采用手动调节增益的方式）和中心频率(位于定量峰和内标峰的中心位置)。
（3）图谱的后处理
通过Topspin 2.1软件进行数据采集，利用Topspin 2.1软件进行处理，依次采用自动（apk）和手动相位调整(包括一级相位调整和二级相位调整)，自动(abs)和手动基线校准及根据氘代溶剂的氢谱数据进行化学位移校正。窗函数采用EM，lb=0.3 Hz。在基线与峰的重合扩大±0.1 Hz范围内进行积分。
（4）纯度计算
定量核磁法定值计算公式如下：
$$ {P_{{\rm{NMR}}}} = \frac{{{I_{{x}}}}}{{{I_{{\rm{std}}}}}} \cdot \frac{{{n_{{\rm{std}}}}}}{{{n_{{x}}}}} \cdot \frac{{{M_{{x}}}}}{{{M_{{\rm{std}}}}}} \cdot \frac{{{m_{{\rm{std}}}}}}{{{m_{{x}}}}} \cdot {P_{{\rm{std}}}} $$ 式中：PNMR为采用核磁共振法测得的被测物的纯度；Ix为样品指定峰的积分面积；Istd为内标物指定峰的积分面积；nstd为内标物指定峰的核群核个数；nx为样品指定峰的核群核个数；Mx为样品的分子量；Mstd为内标物的分子量；mstd为添加的内标物的质量；mx为样品的称样量；Pstd为内标物的纯度。
2 结果与讨论
2.1 不同提取溶剂对大田软海绵酸和鳍藻毒素-1提取效率的影响
本研究培养的利玛原甲藻藻泥经甲醇超声提取后，HPLC-MS/MS检测，提取液中只检测到大田软海绵酸（OA）和鳍藻毒素-1（DTX1），无其他毒素组分。可确定该藻株只产生OA和DTX1，不产生其他腹泻性贝类毒素衍生物（如DTX2、DTX3、DTX4、DTX5a、DTX5b、DTX5c、Acyl-OA、19-epi-OA、DTX1 methyl ester）（图2）。说明这一株系利玛原甲藻是制备OA和DTX1的适宜藻种，无其他毒素衍生物，有利于OA和DTX1的纯化。
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图 2 利玛原甲藻胞内OA和DTX1多重反应监测色谱Fig. 2 Multiple reaction monitoring (MRM) chromatogram showing the presence of numerous okadaic acid and dinophysis toxin-1 in the strain Prorocentrum lima cells.分别用添加了水、酸及碱的甲醇，超声提取破碎的利玛原甲藻细胞，提取液的检测结果表明：不同的提取溶剂中OA、DTX1及其衍生物种类及含量并无显著差异（表2）。在后处理过程中，添加了水、酸或碱的溶液，很难通过旋转蒸发除去，故选择甲醇作为提取溶剂。
表 2 不同试剂提取利玛原甲藻中OA和DTX1毒素的效率Tab. 2 The content of OA and DTX1 in Prorocentrum lima cells under different extraction solvent提取溶剂 OA/µg·g−1 DTX1/µg·g−1 甲醇 48 38 0.1 M乙酸-甲醇（20:80） 47 36 水-甲醇（20:80） 48 37 tris-HCl（pH=8.0）-甲醇（1:2） 45 36 用甲醇反复提取胞内毒素，随着提取次数的增加，OA和DTX1的含量逐渐降低，提取5次后，提取液中已不再检出OA和DTX1（图3）。根据毒素含量及细胞密度可以得出，本项研究的利玛原甲藻胞内OA含量为1.62 pg/cell，DTX1含量为2.19 pg/cell。
英国南岸的一株利玛原甲藻[2]，用甲醇提取，经检测其胞内毒素含量OA 0.4～17.1 pg/cell，DTX1 0.4～11.3 pg/cell，同时在培养液中也检测到OA和DTX1，含量分别为59,581 pg/mL和94,626 pg/mL。曾玲等[15]采用改良的K培养基，发现利玛原甲藻最佳产毒条件为：温度：20 ℃，光照周期：8 L∶16 D，起始密度：6,000 cell/mL，用1∶2的tris-HCl-甲醇提取其胞内毒素，提取3次，酶联免疫检测试剂盒检测，OA的含量最高可以达到50.90 pg/cell。钟娜、杨维东等[19-20]进行了不同的氮源和磷源对利玛原甲藻生长和产毒的研究，发现利玛原甲藻毒素的分泌与环境中营养盐的形态有关。
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图 3 不同提取批次利玛原甲藻藻泥中OA和DTX1的含量Fig. 3 The content of OA and DTX1 in Prorocentrum lima cells under different extraction times2.2 大孔吸附树脂HP20富集胞外毒素及初步纯化毒素
富集培养液中毒素的大孔吸附树脂柱，经95%的乙醇洗脱，HPLC-MS/MS检测培养液中的毒素（即胞外毒素）的组成及含量。结果显示，利玛原甲藻培养液中的毒素主要为OA和DTX1，浓度分别为16.44 µg/L和13.14 µg/L。
固相吸附毒素跟踪技术（solid phase adsorption toxin tracking，SPATT）最早由MacKenzie等提出，用于监测水体中的毒素变化[21]。最常用的吸附剂为Diaion HP系列和Sepabeads SP系列大孔吸附树脂。有研究揭示大孔树脂HP20吸附海水中OA和DTX1的过程主要是树脂的微孔结构发挥了主要作用[22]。Fux等[23]发现大孔吸附树脂HP20无论是在室内还是室外试验对腹泻性贝类毒素OA和DTX1均有很好的吸附效果，是监测海水中毒素的首选吸附材料。在“固相吸附毒素跟踪技术”中洗脱毒素多用甲醇，但在实验过程中用乙醇毒性更小，故本项研究采用乙醇作为大孔树脂洗脱溶剂。
大孔吸附树脂HP20也可用于OA和DTX1初步纯化。藻泥提取液及上述洗脱液蒸除醇类溶剂后，纯净水稀释上样。吸附结束后，先用8倍柱体积的纯净水冲洗树脂柱，除去吸附的盐等无机杂质，然后依次用50%、60%、70%、80%和90%的乙醇溶液淋洗树脂柱，每一比例2 L（约1倍柱体积），每500 mL收集一瓶，依次编号1#—15#。HPLC-MS/MS检测收集瓶中的毒素组成及含量（图4）。结果显示：5#和6#主要是OA，7#—11#是OA和DTX1的混合物，12#和13#中主要为DTX1。虽然用大孔吸附树脂可以将少部分OA和DTX1分开，但大部分的OA和DTX1无法分离，故下一步考虑用同大孔吸附树脂分离原理完全不同的高效制备液相色谱进一步提纯OA和DTX1。
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图 4 大孔树脂HP20吸附柱上OA和DTX1的乙醇洗脱效率Fig. 4 Ethanol elution efficiency of OA and DTX1 on macroporous resin HP20 adsorption column2.3 制备型高效液相色谱纯化毒素
由于OA和DTX1无紫外吸收，因此用制备型高效液相色谱系统（配有紫外检测器）纯化毒素采用全收集模式，收集全部流出液，每3 min收集一瓶，共收集17瓶，高效液相色谱-质谱联用分析方法检测。结果显示：在21～27 min，收集到的主要馏分为OA；在39～45 min，收集到的主要馏分为DTX1（图5）。在此步骤中，分别得到OA和DTX1的粗品（纯度≥70%）。
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图 5 不同收集瓶中OA和DTX1的含量Fig. 5 The content of OA and DTX1 in different retention time via preparation high performance liquid chromatography再次制备时，用配有质谱检测器的半制备型高效液相色谱系统，实时监测馏出液中的毒素组分的荷质比（m/z）。上一步得到OA和DTX1粗品分别再制备。制备液浓缩干燥后，分别得到26 mg和31 mg白色固体粉末，高效液相色谱-质谱联用分析方法检测，同OA和DTX1标准品的保留时间一致。
2.4 毒素结构鉴定及纯度分析
纯化后的OA和DTX1用高分辨质谱（HRMS）和核磁共振氢谱（1H-NMR）进行结构确认（图6）。根据正负离子质谱（图6a和图6b）实验结果，可以确定该化合物的分子量为804.4601，对应的分子式为C44H68O13，同OA的分子式一致。根据正负离子质谱（图6c和图6d）实验结果，可以确定化合物的分子量为818.4754，对应的分子式为C45H70O13，同DTX1的分子式一致。
核磁共振氢谱（1H NMR）结果表明得到的毒素固体就是大田软海绵酸（OA）和鳍藻毒素-1（DTX1）（图7）。定量核磁检测纯度，纯化后的OA纯度为99.39%，DTX1纯度为99.26%。
3 结 论
（1）本项研究中的利玛原甲藻株系易于室内批量培养，所分泌毒素主要为大田软海绵酸（OA）和鳍藻毒素-1（DTX1），未发现其他腹泻性贝类毒素衍生物，结构少，有利于OA和DTX1提取与纯化。
（2）利玛原甲藻胞内毒素的适宜提取溶剂为甲醇，提取5次后即可达到很好的效果。
（3）用大孔吸附树脂HP20可有效富集胞外的OA和DTX1，并用作初步纯化毒素的手段。
（4）经过制备型高效液相色谱纯化2～3次后，可获得纯度大于99%的OA和DTX1，满足标准物质研制的要求。
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图 2 利玛原甲藻胞内OA和DTX1多重反应监测色谱
Fig. 2. Multiple reaction monitoring (MRM) chromatogram showing the presence of numerous okadaic acid and dinophysis toxin-1 in the strain Prorocentrum lima cells.
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图 3 不同提取批次利玛原甲藻藻泥中OA和DTX1的含量
Fig. 3. The content of OA and DTX1 in Prorocentrum lima cells under different extraction times
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图 4 大孔树脂HP20吸附柱上OA和DTX1的乙醇洗脱效率
Fig. 4. Ethanol elution efficiency of OA and DTX1 on macroporous resin HP20 adsorption column
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图 5 不同收集瓶中OA和DTX1的含量
Fig. 5. The content of OA and DTX1 in different retention time via preparation high performance liquid chromatography
表 1 HPLC-MS/MS检测利玛原甲藻中OA、DTX1及其衍生物的质谱条件
Tab. 1 The analysis condition of OA and DTX-1 and its derivatives in Prorocentrum lima c ells by HPLC-MS/MS
名称 Q1 Q3 OA 803 255 DTX1 817 577 DTX2 803 577 DTX3 1055 − DTX4 1509 1311.1 DTX5a 1458 937 DTX5b 1472 951 DTX5c 1430 714 Acyl-OA 1041 − 19-epi-OA 803 785 DTX1 methyl ester 831 813 
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表 2 不同试剂提取利玛原甲藻中OA和DTX1毒素的效率
Tab. 2 The content of OA and DTX1 in Prorocentrum lima cells under different extraction solvent
提取溶剂 OA/µg·g−1 DTX1/µg·g−1 甲醇 48 38 0.1 M乙酸-甲醇（20:80） 47 36 水-甲醇（20:80） 48 37 tris-HCl（pH=8.0）-甲醇（1:2） 45 36
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百度学术
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