氮是水体中很多浮游植物所必需的营养物，而硝酸盐是海水中氮的主要无机形式，是浮游生物摄取的重要氮组分。但是，过量硝酸盐的输入又会导致水体富营养化，严重破坏海洋生态环境^[1]。因此，在海洋生物地球化学研究和环境评估中，硝酸盐都是至关重要的参数^[2]。高效、准确、可靠的检测方法是获取水体环境中高质量硝酸盐数据的前提。

基于镉−铜还原法的分光光度法是检测海洋环境中硝酸盐的常用方法，因其具有还原率高、再现性好、盐效应稳定和测定浓度范围较宽等优点而被广泛应用^[3-4]，同时也是我国海洋调查与监测中的标准方法^[5]。该方法的核心装置为镉−铜还原柱（图1a），主要采用长颈玻璃器具用于盛放镉粒，并在末端加装一个活塞阀门控制流速，样品过柱依靠重力和大气压强进行。该方法需要操作人员不间断值守，以避免镉−铜还原柱发生过空而导致镉柱还原率下降，且流速控制由手动旋转阀实现，无法精确设定恒定流速，可能会影响数据的精密度。

图  1  Cd−Cu还原柱各类装置示意图

Fig.  1  Schematic diagram of various types of Cd−Cu reduction column devices

下载: 全尺寸图片 幻灯片

在实际操作过程中，为对上述缺陷进行改进，可加装一个蠕动泵作为流速控制装置来替代原有阀门，实现流速精确控制（图1b）^[6-7]。但过柱操作仍需人工不间断值守，原有瑕疵仍未得到有效解决。同时，对镉粒堆积密集的镉−铜还原柱来说，蠕动泵工作时还会产生断流现象^[7-8]。此外，蠕动泵管因长期挤压变形，也会导致流速控制不准确。

基于对解放人工值守、提升装置稳定性和改进流速控制的需求，本工作在传统使用的镉−铜还原柱基础上引入程控注射泵来改进与提升半自动流速控制装置（图1c）。通过与传统装置进行对比，改进后的装置在实验室测样性能和对实际海水样品测定方面都取得了显著改善。结果表明，新装置在流速控制上较传统装置自动化程度更高、更准确，测试效率和精密度得到了较大提升，是一种适合用于海洋监测一线部门的有效装置。

1   材料与方法

1.1   基于程控注射泵耦合镉−铜还原柱的改进测定装置简介

程控注射泵目前已经广泛用于实际生产、生活和科研工作中。例如，在农药残留检测^[9]和动力学控制辅助化学合成^[10-11]等领域，注射泵可以作为辅助设备帮助实现精确的进样和流速控制。与传统的蠕动泵相比，注射泵具有更好的适用性和便利性，并且价格与蠕动泵相当。考虑到其在流速控制和自动控制方面的优势，本工作引入一种单通道智能注射泵，对流速实现精确调控。其工作的基本原理是：加装在镉−铜还原柱末端的注射泵依靠步进电机推动注射器抽取样品，过柱并进行流速控制。注射泵流速控制装置由注射器和推动模块（包括步进电机及其驱动器、丝杆、支架等）构成，注射器可根据实际需要选择合适规格。注射泵通过一个T型三通阀，使用硅胶软管分别连接镉−铜还原柱末端、注射泵和输出容器。该程控注射泵采用高精度42位步进电机进行驱动，可夹持外径小于50 mm的任意规格注射器，工作时间范围可设置从1 s至99 h，注射泵行程为110 mm，可设置最大线性运行速度为3.17 mm/s，能提供手动控制和“流速+体积”两种抽取和放液模式。

该装置具有如下优势：（1）程控注射泵在流速控制装置方面实现了自动化精确控制流速，本研究中采用的注射泵可控制0.1 mL/min的流速进行调整，稳定性好、准确度高；（2）程控注射泵的引入使精确控制输出体积成为了可能，而且可在测样前进行体积校正，可保证后续输出体积一致，无需在过柱过程中进行二次体积测量；（3）程控注射泵可以设置工作时间，降低了使用本装置进行过柱操作时失误过空的可能性，且实验操作人员无需对镉−铜还原柱进行不间断值守；（4）过柱过程是连续进行的，在抽取样品过程中不会出现断流现象，同时连接软管无机械形变过程，不易发生疲劳损坏。

1.2   改进装置的操作流程

改进装置的样品测试流程如下：首先根据实验需要，更换对应体积的注射器；然后进行体积校正，在程控注射泵界面设置相应的流速和抽取时间（即理论体积），抽取去离子水溶液后释放，通过质量法测量实际体积后对流速和抽取时间进行体积校正；最后进行过柱还原，设置好所需的测样流速后，向镉−铜还原柱上端注入待测溶液，按照12.5 mL/min的流速清洗镉−铜还原柱（一般消耗50 mL），完成后正式进行样品的过柱操作，接取5 mL过柱后的样品即可进行后续的显色反应。

1.3   标准样品和实际样品的测定

1.3.1   加装程控注射泵装置的流速测试

为了获取最佳流速，在2.5～25.0 mL/min范围内，以2.5 mL/min的间隔设定不同流速进行样品测试。将20 μmol/L的硝酸盐溶液和氨性缓冲混合溶液按照上述设定流速通过镉−铜还原柱还原，各流速平行测样3次，通过重氮−偶氮比色法测定得到每个流速下样品的吸光度。通过公式（1）求得与标准浓度有关的校正因子F值^[12-13]：

式中：A_s 表示该流速下20 μmol/L的硝酸盐溶液的吸光度；A_b表示该流速下空白溶液的吸光度。

所需化学试剂均按照《海洋监测规范 第4部分：海水分析》（GB 17378.4－2007）^[5]的要求进行配制，下同。

1.3.2   改进前后装置的性能对比

为比较加装程控注射泵的装置和传统装置在硝酸盐测定过程中的性能，本工作使用已知浓度的硝酸钠溶液进行对比测定，分别绘制标准曲线并进行加标回收实验。依次配制0、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的硝酸盐溶液作为标准曲线；配制8 μmol/L的硝酸盐溶液50 mL作为模拟样品溶液；将80 μL已知浓度为16 mmol/L的硝酸盐溶液加入模拟样品溶液进行加标操作；溶液经两种装置分别过柱还原后经显色，使用1 cm比色皿在540 nm处进行吸光度测定。

上述加标实验平行开展3次，可得到加标前后的测样浓度的相对标准偏差（RSD）和平均加标回收率。过柱时间是通过使用计时器，记录每个样品单次平行测样期间自开始清洗镉柱，至样品过柱还原待显色前的总时长，再进行平均得到。

通过公式（2）计算得到各装置测量的检出限：

式中：C_L为检出限；S_b为测定10次的空白溶液标准偏差；k为该测定装置得到的标准曲线的斜率。

1.3.3   实际样品的测定

搭载2022年10月中国海洋大学“东方红2”调查船在青岛近海的实习航次，通过CTD采水系统分层采集获得108个有效水样，使用玻璃纤维滤膜（Whatman GF/F）将水样过滤后分为两份，分别采用本研究改进的装置和传统装置现场进行海水样品测定。

2   结果与讨论

2.1   加装程控注射泵装置的最佳流速选择

将各流速下的3个平行F值的均值与流速绘制图像（图2）。由图2可知，样品还原受流速影响明显，流速过慢出现了过度还原现象，流速过快则还原不充分。而过柱流速为5.0 ～ 20.0 mL/min时F值基本稳定在平台区，且不同流速F值的RSD<0.7%。当流速处于此平台范围时，镉柱还原过程受流速影响最小。因此，采用5.0 ～ 20.0 mL/min的过柱流速进行操作，能达到较好的效果。该流速范围内的RSD显著低于海洋监测规范采用传统装置操作所给出的数值（2.4%）^[5]，证明采用程控注射泵操作可以获得良好的精密度，这对研究硝酸盐变化幅度较小的生物地球化学过程比较有利。

图  2  F值与对应流速关系图像

Fig.  2  Image of F-value versus corresponding flow rate

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   加装程控注射泵改进前后装置的性能对比

为说明两种装置在测样性能上的差异，采用两种装置分别进行了标准曲线、检出限、加标回收率、精密度和过柱时间等性能测定。两套装置测定得到的标准曲线（图3）均具有良好的线性（R²>0.9995），且斜率无显著性差异；通过进一步分析加装程控注射泵装置前后的硝酸盐测定性能数据（表1），可以看出，对比传统装置，加装程控注射泵的装置检出限为0.05 μmol/L，降低了37.5%；加标回收率为97.5%，提升了3.3%；RSD平均为0.4%，降低了66.7%；平均每个样品过柱时间为5.0 min，减少了37.5%。上述数据充分表明，加装程控注射泵的装置测样结果的准确度、精密度、检出限和过柱时间等性能均有一定的提升。这是由于程控注射泵能对流速进行精准、稳定控制，并减少了人为实验操作失误，从而提高了测样效率并保证了数据质量。

图  3  传统装置和加装程控注射泵装置测定硝酸盐的标准曲线

Fig.  3  Standard curves for the determination of nitrate in conventional devices and in devices equipped with programmable syringe pumps

下载: 全尺寸图片 幻灯片

表  1  传统装置和加装程控注射泵装置硝酸盐测定性能

Tab.  1  Performance of conventional devices and programmable syringe pump devices for nitrate determination

性能参数	传统装置	加装程控注射泵装置
检出限/μmol·L−1	0.08	0.05
加标回收率/（%）	94.4	97.5
RSD（样品浓度下）/（%）	1.0	0.5
RSD（加标浓度下）/（%）	1.3	0.4
过柱时间/min	8.0	5.0

下载: 导出CSV 

| 显示表格

需要说明的是，加装程控注射泵的装置较全自动营养盐分析仪在效率上存在一定差距，但该装置是基于传统装置的低成本改进，且测样结果反映了其性能优异，非常有利于一线监测人员在调查船和实验室内进行灵活操作。

2.3   加装程控注射泵改进前后装置实际海水样品测定数据的对比

实验室加标回收实验表明，加装程控注射泵的装置具有更优的测试性能。本研究进一步对比了两种装置在测定实际样品方面的差异。使用加装程控注射泵前后的装置测定同一批实际海水样品，得到的数据结果绘制成散点图（图4）。分析结果表明，改进前后的两套装置的测定数据具有较高的相关性，采用线性拟合得出的拟合方程为y=（1.06±0.01）x−（0.29±0.23），决定系数R²为0.99。但仅从拟合方程来看，装置改进前后的测定结果可能存在微小的系统误差，为此本工作使用配对t检验来验证装置改进前后样品测定浓度之间的比值是否存在显著性差异。配对t检验结果表明，装置改进前后样品测定数据并不存在显著性差异（图5，t=1.62, df=107, P=0.1035）。

图  4  加装程控注射泵前后样品测定结果相关性

Fig.  4  Scatter plot of correlation between the new device and the conventional devices for nitrate determination

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  5  加装程控注射泵前后样品测定结果的对比

ns表示数据结果差异不显著

Fig.  5  Comparison of samples measured before and after the addition of a programmable syringe pump to the cadmium-copper reduction column, where ns is a non-significant difference in the data results

下载: 全尺寸图片 幻灯片

为进一步全面评估装置改进前后样品测定结果的一致性，本工作采用了Bland-Altman一致性检验^[14]，绘制了两种装置样品测定结果的Bland-Altman图像（图6）。Bland-Altman法作为一种方法对比领域常用的图形分析手段，可以从集中趋势、离散趋势、同步变化程度等多角度评价新旧装置或方法的一致性，能有效弥补t检验、相关分析和回归分析等方法的不足^[15]。根据Bland-Altman图像可知，两种方法得到的样品数据差值平均值为0.61 μmol/L，其允许上界值为2.80 μmol/L，下界值为−1.58 μmol/L。在样品数据中，只有7个数据点的差值高于允许的上界值（占比为6.5 %），而其余的数据点均落在允许的范围内，说明两种方法具有良好的一致性。

图  6  加装程控注射泵前后样品测定结果Bland-Altman一致性图像

Fig.  6  Bland-Altman consistency images of nitrate determination results of the new device and the original device

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3   结 论

（1）为解决国家标准方法使用的传统装置在测定海水中硝酸盐浓度时，存在难以控制精确流速以及需人工不间断值守等问题，本工作引入了一种新型的程控注射泵流速控制装置。改进后的装置具有如下优势：作为半自动化装置，简便快捷，有效降低了过空镉柱的可能性；流速控制更加精准、稳定，便于细致流速调整；能精确定量输出体积，在测样工作开始前完成体积校正，无需每次过柱后再进行体积测定；样品过柱过程是连续流，对连接软管损害更小。

（2）在测定硝酸盐标准溶液时，加装程控注射泵后的装置较传统装置在精密度和过柱效率等性能上均有一定提升，分别为0.4%和5.0 min，且检出限更低，为0.05 μmol/L。这表明改进后的装置具有更优的精密度、准确度以及更高的效率。

（3）使用相关性散点图、配对t检验和Bland-Altman一致性检验3种方法，对两种装置的实际海水样品中硝酸盐浓度的测定数据进行分析，结果表明，加装程控注射泵前后的测定数据具有良好的相关性和一致性，且测量结果之间无显著性差异。