Toxic effects of amino-modified polystyrene nanoplastics their filtrates on Tigriopus japonicus
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摘要:
纳米塑料具有体积小、比表面积大等特点，能够对海洋生物产生潜在不利影响。然而，目前毒理学研究主要使用的是商品化纳米塑料悬液，其中的添加剂组分可能导致纳米塑料毒性效应出现“假阳性”，对科学评价其真实毒性效应造成一定干扰。本研究以海洋桡足类日本虎斑猛水蚤（Tigriopus japonicus）为受试生物，采用长期暴露（24 d）的方式探究环境相关浓度（5.5 μg/L、55 μg/L和550 μg/L）的50 nm氨基修饰聚苯乙烯（PS-NH2）及其滤液（含添加剂组分）对猛水蚤在存活、生长发育和繁殖等方面的毒性效应。结果表明，PS-NH2及其滤液均能够降低猛水蚤的存活率和体长；550 μg/L的PS-NH2延长了猛水蚤的发育时间和蜕皮时间间隔，而PS-NH2滤液未产生以上影响。PS-NH2及其滤液均会导致猛水蚤孵化时间延长以及孵化幼体数量减少；与PS-NH2相比，PS-NH2滤液单独暴露下的雌性猛水蚤卵囊脱落比例更高。总体而言，PS-NH2对猛水蚤的存活和发育效应大于PS-NH2滤液，对繁殖的不利影响小于PS-NH2滤液，表明PS-NH2微球与滤液中的添加剂组分间可能存在复杂的相互作用模式。相关研究结果对科学评估纳米塑料的生态风险具有一定参考价值。
Abstract:Nanoplastics are able of causing adverse effects to marine organisms owing to their small size and large surface area to mass ratio. However, the presence of suspension additives in commercial nanoplastics widely employed in toxicological studies may introduce artifacts into nanoplastics toxicity assessments. In this study, the marine copepod Tigriopus japonicus was used as the test organism, and long-term exposure (24 d) was used to investigate the toxic effects of 50 nm amino-modified polystyrene nanospheres (PS-NH2) and their filtrates (containing additive components) at environmentally relevant concentrations (5.5 μg/L, 55 μg/L and 550 μg/L) on the survival, growth, development and reproduction of T. japonicus. Our results revealed that both PS-NH2 and their filtrates decreased the survival rate and body length of T. japonicus. At 550 μg/L PS-NH2 exposure, the average molting interval and the development time to adult were delayed, while PS-NH2 filtrates did not causethese toxicity effects. PS-NH2 and their filtrates extended the hatching time, reduced number of nauplii. Compared to PS-NH2, PS-NH2 filtrates caused a higher rate of deciduous oocysts in female T. japonicus. In general, PS-NH2 had a more adverse effect on survival and development than PS-NH2 filtrates, and a less adverse effect on reproduction than PS-NH2 filtrates, indicating a complex interaction pattern between PS-NH2 nanospheres and additive components. Our findings contributed to the ecological risk assessment of nanoplastics in the marine environment.
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Keywords:
- nanoplastics /
- amino-modified polystyrene /
- zooplankton /
- additive /
- development and reproduction
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纳米塑料（nanoplastics, NPs；粒径为1 nm～1 μm）是海洋环境中的一类新污染物，具有粒径小、生物可利用度高等特点，对海洋生态系统和人体健康的潜在危害引起广泛关注[1-2]。海洋是NPs重要的汇[3]，一方面，来源于生活产品（如个人护理品）和医学产品（如纳米药物）等生产过程中直接制造的NPs被排放进入海洋[4]；另一方面，进入海洋环境的塑料或微塑料（粒径为1 μm ～ 5 mm）在风力、微生物、紫外线、洋流等作用下也会逐步破碎成NPs，并在全球海洋环境中迁移[2]。随着采样、分离提取和鉴定技术的提升，NPs在全球不同海域的水体中检出，例如，荷兰瓦登海表层水体中检出的NPs（粒径：< 200 nm）浓度范围为2.7 ～ 6.5 μg/L[5]，我国渤海海域的表层海水中检测到NPs的浓度范围为< 0.07 ～ 0.73 μg/L[6]。全球海洋环境（海水和沉积物）中检出的NPs类型主要包括聚苯乙烯（polystyrene, PS）、聚乙烯（polyethylene, PE）、聚丙烯（polypropylene, PP）和聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate, PET）[7-10]等，其中PS是检出次数最多的聚合物类型之一[5-6,8]。随着NPs在海洋环境中的持续检出，其对海洋生物的潜在危害已不容忽视。
NPs能够穿过生物屏障转移至生物体不同器官或组织中，进而引发存活、发育和繁殖能力等方面的不利影响[11-12]。研究表明，暴露在5 mg/L的50 nm PS溶液中5 d后，淡水枝角类盔型溞（Daphnia galeata）体表的PS转移至卵巢等生殖器官中，盔型溞的存活率和孵化率降低，胚胎发育异常[13]。海洋桡足类日本虎斑猛水蚤（Tigriopus japonicus）暴露于浓度为1.25 mg/L的50 nm PS微球溶液16 d，无节幼体发育阶段延长，存活率下降，暴露于相同浓度的500 nm PS后繁殖能力显著降低[14]。海洋鱼类黑点青鳉（Oryzias melastigma）暴露在55 μg/L的50 nm PS微球溶液中21 d，出现胚胎死亡率上升和仔鱼发育畸形等[15]。由此可见，探究NPs对海洋生物的毒性效应对其生态风险评估具有重要意义。
由于不同形状、聚合物类型的NPs获取存在困难，当前NPs的毒理学研究主要聚焦于商品化PS纳米微球[16-18]。然而，商品化纳米微球制剂的悬浮液中含有防腐剂、抗菌剂和表面活性剂等多种添加剂，在NPs的毒理学研究中容易被忽视[19]。研究发现，不同尺寸（20 nm和200 nm）的商品化PS微球在浓度为10 mg/L时对大型溞（Daphnia magna）存活的影响主要由添加剂叠氮化钠造成，与NPs本身无关[20]；商品化羧基修饰聚苯乙烯（carboxyl-modified polystyrene, PS-COOH）微球（26 nm，100 mg/L）溶液对羊角月牙藻（Raphidocelis subcapitata）和大型溞的毒理学研究结果表明，除了叠氮化钠，添加剂中的其他表面活性剂组分（如吐温-20和十二烷基硫酸钠）也会对这两种生物产生致死效应[21]。可见，商品化NPs中添加剂对水生生物的毒性效应可能会在一定程度上干扰NPs的毒性。
海洋桡足类是海洋浮游动物类群的重要组成部分，在海洋生态系统的能量传递和物质循环过程中起着重要的作用[22]。日本虎斑猛水蚤作为我国近海常见的一种代表性桡足类生物[23]，具有繁殖能力强和生命周期短等特点[23-24]，近年来广泛应用于污染物的毒理学研究。除了以上提及的表面无基团修饰的商品化PS纳米微球，表面带有电荷的NPs如携带负电的PS-COOH微球和携带正电荷的氨基修饰聚苯乙烯（amino-modified polystyrene, PS-NH2）微球也是近年来的研究热点[25]，二者在生物传感器、药物运输载体等方面应用广泛[26]。与PS-COOH相比，PS-NH2往往具有更强的毒性[27-28]。例如，50 nm PS-NH2纳米塑料能够抑制盐生杜氏藻（Dunaliella tertiolecta）的生长（EC50 = 12.97 mg/L），而40 nm的PS-COOH没有出现上述现象[25]。本研究使用日本虎斑猛水蚤作为受试生物，探究商品化PS-NH2微球及其滤液对猛水蚤在存活、生长发育和繁殖等方面的毒性效应，以期为科学评估纳米塑料的生态风险提供依据。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 实验仪器
体视荧光显微镜（Leica M205FA，德国）；倒置荧光显微镜（Leica DMI4000B，德国）；冷冻离心机（Sigma 3K-15，美国）；超纯水机（Millipore Synergy-UV，美国）；多参数水质检测仪（WTW Multi 3630 IDS，德国）。
1.1.2 实验试剂
非荧光PS-NH2（50 nm）溶液采购于美国Bangs Laboratories，浓度为100 g/L，生产厂家安全数据表显示，PS-NH2溶液中含有吐温-20、十二烷基硫酸钠（两种成分浓度≤ 500 mg/L）和叠氮化钠（浓度≤ 90 mg/L）等添加剂。本课题组在先前研究中使用动态光散射和透射电子显微镜对PS-NH2的形态和粒径等特性进行表征，表明PS-NH2具有球形结构，粒径为（50.7 ± 0.8） nm，zeta电位为+（24.13 ± 0.66） mV[29]；人工海盐（珊瑚礁级）采购于中盐工程技术研究院有限公司；戊二醛溶液（25%，分析纯）采购于沈阳医药股份有限公司化玻公司。
1.2 受试生物
本研究所用受试生物为日本虎斑猛水蚤，于2016年4月引种自厦门大学海洋与地球学院近海海洋环境科学国家重点实验室。猛水蚤培养条件为：温度为（22 ± 1） ℃，光照强度约为5000 lux，光周期为12/12 h，盐度为（28.6 ± 0.2），pH为（8.083 ± 0.007），溶解氧浓度为（8.01 ± 0.10） mg/L。以小球藻（Chlorella vulgaris）为饵料投喂日本虎斑猛水蚤，投喂密度为1×107 cells/mL。
1.3 暴露溶液制备
本研究参考荷兰瓦登海表层水体中检出的NPs（粒径：< 200 nm）浓度范围（2.7 ～ 6.5 μg/L）[5]，设置暴露溶液的浓度为5.5 μg/L、55 μg/L和550 μg/L。
PS-NH2暴露溶液制备：利用浓度为100 g/L的非荧光PS-NH2原液配制成浓度为1.1 mg/L、11 mg/L和110 mg/L的PS-NH2储备液（溶液介质为超纯水），在玻璃瓶中4 ℃避光保存。取一定体积的3种浓度PS-NH2储备液至12孔板中，加入过滤人工海水至4 mL，获得浓度分别为5.5 μg/L、55 μg/L和550 μg/L的PS-NH2暴露溶液。
PS-NH2滤液暴露溶液制备：将不同浓度的PS-NH2储备液在4 ℃下16000 g离心2 h。使用0.02 μm的针头过滤器（AnotopTM 25，WhatmanTM，德国）过滤离心后的上清液（约占离心管的三分之二），获得PS-NH2滤液储备液，在玻璃瓶中4 ℃避光保存。取20 μL 3种浓度的添加剂滤液储备液至12孔板中，加入过滤人工海水至4 mL，获得浓度为5.5 μg/L、55 μg/L和550 μg/L的PS-NH2滤液。
1.4 慢性毒性实验
利用猛水蚤无节幼体进行慢性毒性暴露实验，同步考察PS-NH2及其滤液对猛水蚤产生的毒性影响。随机挑选无节幼体（< 24 h）置于12孔板中，以过滤人工海水为空白对照，暴露体积和暴露溶液浓度见1.3节，每孔放置1只猛水蚤，每15只猛水蚤作为1个平行，每个处理组设置3个平行。每天利用体视荧光显微镜观察并记录猛水蚤个体存活和发育情况。当猛水蚤发育至成体时，记录性别比，将雌、雄成体放置于12孔板中24 h进行交配，每个孔中放置一对猛水蚤，每5对猛水蚤作为1个平行。将带有卵囊的雌性个体转移至新的12孔板中，以相同条件继续暴露10 d，每天观察并记录猛水蚤繁殖情况（产卵时间、孵化时间、孵化次数和孵化幼体数等）。若24 h后雌性未产生卵囊，则重新选择雄性进行交配。慢性毒性实验在人工气候培养箱（参数设置与猛水蚤培养时一致，见1.2节）中进行，通过多参数水质检测仪测定过滤人工海水的盐度、pH和DO等水质参数，每48 h更新一次暴露溶液，并投喂密度为1×107 cells/mL的小球藻。暴露结束（第24 d）后，将所有存活的猛水蚤个体（13 ≤ n ≤ 15）用于体长测定。使用超纯水清洗猛水蚤3 ～ 4次，去除体表附着的微藻等物质，随后转移至1.5 mL的离心管中，加入1 mL的2.5%戊二醛固定液在4 ℃下固定24 h，通过倒置荧光显微镜拍照并测定猛水蚤个体的体长。慢性毒性实验中涉及的实验终点及判断标准见表1和图1。
表 1 慢性毒性实验毒性终点及判断标准Tab. 1 Toxicity endpoints and their judgment criteria of chronic toxicity test毒性效应 毒性终点 判断标准 存活效应 存活率/（%） 停止活动，使用吸管触碰后15 s内无反应，头胸与尾部呈直角状[30] 发育效应 发育时间/d 无节幼体−桡足幼体（N-C）时间：猛水蚤发育至桡足幼体第一阶段（C1），身体分为5节，游泳速度明显加快；无节幼体−成体（N-A）时间：猛水蚤发育至成体，其中雄性触角特化成执握器；雌性能够观察到愈合的生殖节[31]（图1） 体长/μm 头部（不含第一触角）至尾叉（不含尾触毛）的长度（图1） 蜕皮次数 — 平均蜕皮时间间隔/d 相邻两次蜕皮发生时间差的平均值 繁殖效应 性别比 雌性个体数量与雄性个体数量之比 产卵时间/d 雌性腹部产生墨绿色卵囊的时间，暴露实验结束时仍未产卵的个体按总暴露时间（24 d）计 孵化时间/d 卵囊孵化出无节幼体的时间，暴露实验结束时仍未孵化幼体的个体按总暴露时间（24 d）计 孵化次数 — 孵化幼体数 — ![]()
图 1 日本虎斑猛水蚤雄性成体（左）、雌性成体（右）及体长测量方法图示红色箭头所示雄性，黑色箭头所示雌性成体特征Fig. 1 Characteristics of adult male (left) and female (right) of Tigriopus japonicus and determination of body length1.5 数据统计与分析
采用SPSS 27.0软件对数据进行统计和分析。采用Kolmogorov-Smirnor检验和Levene检验分别检验数据的正态性和方差齐性。采用皮尔逊相关系数分析各毒性效应终点与暴露浓度间的相关性。双因素方差分析用于分析实验中暴露浓度（0 μg/L、5.5 μg/L、55 μg/L和550 μg/L）与污染物类型（PS-NH2和PS-NH2滤液）之间的交互作用。如果存在交互作用（p < 0.05），采用单因素方差分析和事后多重比较（LSD）进行不同暴露浓度组间的差异显著性检验；采用t检验进行不同污染物类型组间的差异显著性检验。结果以平均值±标准差表示，当p < 0.05时认为具有显著性差异。
2 结果与讨论
2.1 纳米塑料及其滤液对猛水蚤存活率的影响
PS-NH2及其滤液各处理组均从第6 d出现猛水蚤个体死亡现象，暴露14 d后，猛水蚤的存活率明显下降，存活率与暴露溶液浓度呈显著负相关关系（PS-NH2：r = −0.932，p < 0.05；PS-NH2滤液：r = −0.720，p < 0.05）（图2）。550 μg/L PS-NH2处理组的14 d存活率（86.7% ± 0.0%）显著低于相同浓度滤液处理组的存活率（91.1% ± 3.1%）（p < 0.05）。
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图 2 不同浓度氨基修饰聚苯乙烯纳米微球（A）及其滤液（B）对日本虎斑猛水蚤14 d存活率的影响不同字母表示各处理组之间第14 d的存活率存在显著差异（单因素方差分析，p < 0.05）Fig. 2 Effects on the survival rate of Tigriopus japonicus during the 14 d exposed to amino-modified polystyrene nanospheres (A) and their filtrates (B) at various concentrations2.2 纳米塑料及其滤液对猛水蚤生长发育的影响
2.2.1 发育时间
与对照组相比，高浓度（550 μg/L）PS-NH2处理组导致猛水蚤N-C的发育时间延长了（1.6 ± 0.1） d（p < 0.05）（图3A），进而导致猛水蚤发育至成体的时间延长了（1.5 ± 0.1 ）d（p < 0.05）（图3B）。双因素方差分析结果显示，对于猛水蚤的发育时间，暴露浓度与污染物类型之间存在显著交互作用（p < 0.05）（表2）。
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图 3 不同浓度氨基修饰聚苯乙烯纳米微球（PS-NH2）及其滤液对日本虎斑猛水蚤生长发育的影响A：猛水蚤从无节幼体发育至桡足幼体（N-C）发育时间，B：猛水蚤从无节幼体发育至成体（N-A）发育时间，C：体长，D：平均蜕皮时间间隔，E：蜕皮组织。C5-A表示猛水蚤从桡足幼体第5阶段发育至成体，C3-C4表示桡足幼体第3阶段发育至第4阶段。*（p < 0.05），**（p < 0.01）和***（p < 0.001）表示处理组与对照组相比存在显著性差异（单因素方差分析）；#（p < 0.05）和##（p < 0.01）表示相同浓度、不同污染物类型处理组之间各个指标存在显著差异（t-检验）Fig. 3 Effects on the growth and development of Tigriopus japonicus exposed to amino-modified polystyrene nanospheres (PS-NH2) and their filtrates at various concentrations表 2 不同污染物类型（P）和暴露浓度（C）对日本虎斑猛水蚤存活、生长发育和繁殖等方面影响的双因素方差分析结果Tab. 2 Results of two-way analysis of variance on the effects of different pollutant types (P) and exposure concentrations (C) on survival, growth, development and reproduction of Tigriopus japonicus影响因素 MSE F P 影响因素 MSE F P 存活率 首次产卵时间 P 42.667 6.024 0.026* P 0.807 3.293 0.088 C 123.389 17.420 < 0.001* C 2.166 8.839 0.001* P*C 5.889 0.831 0.496 P*C 0.983 4.014 0.026* 发育时间（无节幼体至桡足幼体） 首次孵化时间 P 0.844 202.500 < 0.001* P 0.602 0.307 0.587 C 1.115 267.567 < 0.001* C 14.440 7.377 0.003* P*C 0.658 157.967 < 0.001* P*C 4.717 2.410 0.105 发育时间（无节幼体至成体） 孵化次数 P 0.960 288.000 < 0.001* P 0.735 2.075 0.169 C 0.834 250.167 < 0.001* C 1.383 3.904 0.029* P*C 0.761 228.333 < 0.001* P*C 1.245 3.515 0.040* 平均蜕皮时间间隔 每窝孵化幼体数 P 0.010 3.125 0.096 P 69.700 4.324 0.054 C 0.027 8.125 0.002* C 306.148 18.993 < 0.001* P*C 0.012 3.458 0.041* P*C 55.940 3.471 0.041* 体长 孵化幼体总数 P 0.295 0.466 0.505 P 6970.042 1.614 0.222 C 33.355 52.754 < 0.001* C 39209.153 9.082 0.001* P*C 5.221 8.258 0.002* P*C 12152.819 2.815 0.073 性别比 P 2.394 7.183 0.016* C 0.139 0.417 0.743 P*C 0.377 1.130 0.366 注：污染物类型为PS-NH2和PS-NH2滤液；暴露浓度为0 μg/L、5.5 μg/L、55 μg/L和550 μg/L；MSE为均方误差；*表示p < 0.05 2.2.2 体 长
经24 d暴露后，PS-NH2及其滤液均对猛水蚤的体长具有抑制作用，且猛水蚤的体长与暴露溶液浓度呈显著负相关关系（PS-NH2：r = −0.939，p < 0.05；PS-NH2滤液：r = −0.858，p < 0.05）。与对照组相比，中、高浓度（55 μg/L和550 μg/L）PS-NH2处理组中猛水蚤的体长显著降低（p < 0.05）；PS-NH2滤液处理组（5.5 μg/L、55 μg/L和550 μg/L）中猛水蚤的体长均显著降低（p < 0.05）。此外，低浓度（5.5 μg/L）和高浓度（550 μg/L）PS-NH2与对应的PS-NH2滤液处理组对猛水蚤体长的影响也存在显著差异（p < 0.05）（图3C）。5.5 μg/L PS-NH2处理组中猛水蚤平均体长[（708.0 ± 0.4 ）μm]显著高于对应的PS-NH2滤液处理组[（705.7 ± 0.7 ）μm]（p < 0.05），550 μg/L PS-NH2处理组中猛水蚤平均体长[（702.3 ± 0.5 ）μm]显著低于对应的 PS-NH2滤液处理组[（704.4 ± 0.2） μm]（p < 0.05）。
2.2.3 蜕皮情况
与对照组（蜕皮次数：11次）相比，不同浓度的PS-NH2及其滤液对猛水蚤的蜕皮次数没有影响（均为11次），但影响平均蜕皮时间间隔。对照组中的平均蜕皮时间间隔为（1.1 ± 0.04） d，高浓度（550 μg/L）PS-NH2处理显著延长了猛水蚤平均蜕皮时间间隔（p < 0.05），为（1.3 ± 0.06） d，而对应的PS-NH2滤液对猛水蚤的平均蜕皮时间间隔无显著影响（p > 0.05）（图3D）。双因素方差分析结果显示，对于猛水蚤的平均蜕皮时间间隔，暴露浓度与污染物类型之间存在显著交互作用（p < 0.05）（表2）。此外，通过观察猛水蚤的蜕皮组织发现，当对照组的蜕皮组织处于桡足幼体第5阶段−成体阶段（C5-A）时，暴露于550 μg/L的PS-NH2处理组中猛水蚤的蜕皮组织处于桡足幼体第3阶段−第4阶段（C3-C4）（图3E）。
暴露浓度是影响NPs海洋生物毒性效应的关键因素之一。一般来讲，随着浓度的升高，NPs对海洋生物的毒性效应增强。在本研究中，暴露于5.5 μg/L的PS-NH2中14 d，猛水蚤的发育未受到显著影响，当浓度升高至550 μg/L时，猛水蚤的发育时间和平均蜕皮时间间隔显著延长（图3）。类似地，50 nm PS微球浓度从0.1 mg/L升高至1 mg/L时，褶皱臂尾轮虫（Brachionus plicatilis）的繁殖能力显著降低[32]；50 nm PS浓度从0.125 mg/L升高至1.25 mg/L时，猛水蚤的发育时间显著延长[14]；50 nm PS-NH2浓度从5.5 μg/L升高至55 μg/L时，卤虫（Artemia parthenogenetica）的存活率和体长显著下降[29]。
2.3 纳米塑料及其滤液对猛水蚤繁殖的影响
2.3.1 性别比
对照组的雌雄性别比为1.1∶1。与对照组相比，PS-NH2及其滤液各处理组对猛水蚤的性别比无显著影响（p > 0.05）（图4A）。高浓度（550 μg/L）PS-NH2与对应的PS-NH2滤液处理组间猛水蚤的性别比存在显著差异，PS-NH2滤液处理组的性别比显著高于PS-NH2处理组（p < 0.05），分别为2∶1和1∶1。
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图 4 不同浓度氨基修饰聚苯乙烯纳米微球及其滤液对日本虎斑猛水蚤繁殖情况的影响A：性别比，B：首次产卵时间，C：首次孵化时间，D：孵化次数/10 d，E：每窝孵化幼体数/10 d，F：10 d孵化幼体总数，G：脱落的卵囊部分可孵化幼体，H：脱落的卵囊无法孵化幼体（红色箭头所示为可孵化出幼体，白色箭头所示为无法孵化幼体）。*（p < 0.05），**（p < 0.01）和***（p < 0.001）表示处理组与对照组相比存在显著性差异（单因素方差分析）；#（p < 0.05）和##（p < 0.01）表示相同浓度、不同污染物类型处理组间各个指标的显著差异（t-检验）Fig. 4 Effects of different concentrations of amino-modified polystyrene nanospheres and their filtrates on the reproduction of Tigriopus japonicus2.3.2 首次产卵时间
对照组中的雌性猛水蚤首次产卵时间为（14.1 ± 0.2） d。高浓度（550 μg/L）PS-NH2处理组显著延长了猛水蚤产卵时间（p < 0.05），为（16.3 ± 0.7） d（图4B）。双因素方差分析结果显示，对于猛水蚤的首次产卵时间，暴露浓度和污染物类型之间存在显著交互作用（p < 0.05）（表2）。
2.3.3 孵化时间和孵化次数
对照组中的雌性猛水蚤的首次孵化时间的时间为（16.8 ± 0.4） d。高浓度（550 μg/L）PS-NH2和低、中浓度（5.5 μg/L和55 μg/L）PS-NH2滤液显著延长了猛水蚤的首次孵化时间（p < 0.05）（图4C），分别为（20.9 ± 0.2 ）d、（20.1 ± 0.9） d和（21.2 ± 0.9） d。由于孵化时间的延长，与对照组相比，低、中浓度（5.5 μg/L和55 μg/L）PS-NH2滤液导致猛水蚤在10 d内的孵化次数分别减少了（1.4 ± 0.4）次和（1.6 ± 0.5）次（p < 0.05）（图4D）。双因素方差分析结果显示，对于猛水蚤的孵化次数，暴露浓度与污染物类型之间均存在显著的交互作用（p < 0.05）（表2）。
2.3.4 孵化幼体数量
对照组中每只猛水蚤的平均每窝无节幼体数量是（28.7 ± 1.1）只。与对照组相比，PS-NH2及其滤液的各个处理均显著减少了猛水蚤每窝孵化幼体数量（p < 0.05）。此外，低浓度PS-NH2（5.5 μg/L）与对应的PS-NH2滤液处理组间的平均每窝无节幼体数量存在显著差异，PS-NH2滤液处理组显著低于PS-NH2（p < 0.05）（图4E），分别为（10.3 ± 2.1）只和（19.1 ± 2.5）只。双因素方差分析结果显示，对于平均每窝孵化的无节幼体数量，暴露浓度与污染物类型之间存在显著的交互作用（p< 0.05）（表2）。
对照组中每只猛水蚤10 d内平均孵化无节幼体总数为（75.6 ± 7.2）只，由于孵化次数和每窝平均孵化幼体数的减少，高浓度（550 μg/L）PS-NH2和低、中浓度（5.5 μg/L和55 μg/L）PS-NH2滤液处理组孵化幼体总数与对照组相比显著降低（p < 0.05）（图4F），10 d内猛水蚤孵化幼体总数分别减少至（34.7 ± 3.3）只、（23.0 ± 8.2）只和（22.3 ± 6.0）只。此外，在各个浓度的PS-NH2及其滤液处理组中发现了脱落的卵囊（图4G和H），其中5.5 μg/L、55 μg/L和550 μg/L PS-NH2处理组中无法孵化出幼体的卵囊占比分别为10%、41.7%和50%，而对应浓度的PS-NH2滤液处理组的占比高于PS-NH2处理组，分别为64.3%、62.5%和61.5%。
2.4 添加剂对纳米塑料的毒性效应影响分析
尽管商品化NPs已被证明能够对海洋生物产生多种毒性效应，然而这些毒性效应是否可以直接归因于NPs仍受到质疑，悬浮液中的其他组分也可能会对生物产生一定影响。因此，本研究通过离心和过滤获得PS-NH2滤液用于暴露实验，结果表明，滤液能够降低猛水蚤的14 d存活率，并造成雌性猛水蚤的卵囊脱落，进而导致猛水蚤孵化幼体数量减少。与本研究结果类似，卤虫暴露在浓度550 μg/L的1 μm PS-NH2滤液中时，也出现了体长显著下降和发育龄期显著延迟等现象[29]。商品化PS微球滤液对生物造成的毒性可能是由于其中的添加剂组分所引起的。通常而言，滤液中含有防腐剂、抗菌剂和表面活性剂等添加剂组分，主要成分包括吐温-20、十二烷基硫酸钠和叠氮化钠等，这些组分能够对生物的生理生化、繁殖和生长发育等方面产生不利影响[33-36]。例如，十二烷基硫酸钠会通过破坏生物膜和亚细胞器，降低某些酶的活性，导致鱼类受精成功率降低[33]；吐温-20能通过与细胞中DNA相互作用，抑制细胞生长，诱导细胞凋亡，进而导致生物发育异常[34]；叠氮化钠能够造成生物体内过氧化氢酶活性和线粒体膜电位降低[35-36]，从而影响生物的生理功能。
添加剂与微纳米塑料共存时可能存在复杂的相互作用和毒性效应，进而对科学评价微纳米塑料的真实毒性效应造成一定干扰（表3）。本研究中，PS-NH2滤液（添加剂组分）对猛水蚤存活率、体长、孵化时间和孵化幼体数量等毒性终点的影响可能与PS-NH2（纳米微球与添加剂组分共存）相似。另一项研究结果与本研究类似，当添加剂与PS-NH2共存时，卤虫的体长显著下降，发育龄期延迟，而添加剂单独存在时，同样也会造成生长发育抑制[29]。在本研究中，对于发育时间、平均蜕皮时间间隔和产卵时间等毒性终点，PS-NH2滤液没有产生显著的毒性效应，而PS-NH2能够延长猛水蚤的发育时间和平均蜕皮时间间隔。类似地，有研究指出，当添加剂和NPs共存时，黑点青鳉的存活率降低，且肝脏组织出现炎症反应，而当添加剂单独存在时，黑点青鳉没有产生上述毒性效应[15]。因此，添加剂组分和纳米微球间可能存在复杂的相互作用模式，在探究NPs对海洋生物的毒性效应时，应关注添加剂对NPs自身毒性效应的贡献并尽可能消除其影响。为了阐明微纳米塑料对海洋生物的毒性作用，已经有研究采用透析、超滤等方式对商品化微纳米塑料进行分离纯化[37]，以达到评估微纳米塑料毒性的目的。例如，Pikuda等[20]对商品化PS-NPs透析24 h，通过去除商品制剂中的添加剂组分以评估NPs对大型溞的真实毒性，结果表明，透析后的PS-NPs对大型溞没有产生致死效应，但能够抑制大型溞的游泳行为；Wang等[38]通过对商品化PS微球离心和过滤获得添加剂组分，并证明了添加剂组分对紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）的活性氧水平、抗氧化酶活性和免疫相关基因表达等方面未产生不良反应。因此，后续研究将对商品化PS-NH2进行透析，以去除添加剂的影响，进一步探究添加剂在PS-NH2对猛水蚤毒性效应中所起的作用。
表 3 商品化微纳米塑料及其添加剂组分对水生生物毒性研究Tab. 3 Toxicity studies of commercialized micro- and nanoplastics and their additive components on aquatic organisms塑料
粒径/nm聚合物
类型暴露浓度
/μg·L−1暴露
时间/d添加剂成分 受试生物 分离纯化
方式添加剂对微纳米塑料
毒性的影响参考文献 20，200 PS 1×104 2 叠氮化钠（2 mM） 大型溞
（Daphnia magna）透析 添加剂导致PS毒性升高，造成大型溞死亡 [20] 26，100 PS-COOH 1×105 2 吐温-20/SDS
（≤ 0.5%），
叠氮化钠
（26 nm：≤ 0.05%；
100 nm：≤ 0.09%）D. magna
羊角月牙藻
（Raphidocelis subcapitata）透析 添加剂导致PS-COOH毒性升高，造成大型溞与月牙藻死亡 [21] 50 PS 55 21 吐温-20/SDS
（≤ 0.1%），
叠氮化钠
（≤ 0.09%）黑点青鳉
（Oryzias melastigma）离心，
过滤添加剂未产生毒性效应，PS能够导致黑点青鳉仔鱼存活率降低，发育畸形及肝脏损伤 [15] 1000 PS-NH2 550 14 吐温-20/SDS
（≤ 0.1%），
叠氮化钠
（≤ 0.09%）卤虫
（Artemia parthenogenetica）离心，
过滤添加剂以及PS-NH2与添加剂共存时均能够导致卤虫体长降低、发育龄期延迟 [29] 1×105 PS 5.5 4 吐温-20/SDS
（≤ 0.1%），
叠氮化钠
（≤ 0.09%）紫贻贝
（Mytilus galloprovincialis）离心，
过滤添加剂未产生毒性效应，PS能够导致紫贻贝消化小管的厚度变薄，增强活性氧水平，免疫、解毒相关基因表达水平降低 [38] 50 PS-NH2 5.5
55
55024 吐温-20/SDS
（≤ 0.1%），
叠氮化钠
（≤ 0.09%）日本虎斑猛水蚤
（Tigriopus japonicus）离心，
过滤对于存活率、体长、孵化时间和孵化幼体数量等毒性终点，添加剂导致PS-NH2毒性升高；对于发育时间、平均蜕皮时间间隔和产卵时间等毒性终点，添加剂没有产生毒性效应，而PS-NH2则延长了猛水蚤的发育时间、平均蜕皮时间间隔和产卵时间 本研究 注：SDS表示十二烷基硫酸钠 3 结 论
（1）PS-NH2及其滤液均能够降低猛水蚤的存活率和体长；550 μg/L的PS-NH2使得猛水蚤的平均蜕皮时间间隔延长至（1.3 ± 0.06） d，发育至成体的时间较对照组延长了（1.5 ± 0.1） d，而PS-NH2滤液未产生此类影响。
（2）PS-NH2及其滤液均导致猛水蚤的孵化时间延长和孵化幼体数量减少；与PS-NH2相比，PS-NH2滤液单独暴露下的雌性猛水蚤卵囊脱落的比例更高，5.5 μg/L PS-NH2滤液导致平均每窝无节幼体数量显著低于对应浓度的PS-NH2处理组。
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图 1 日本虎斑猛水蚤雄性成体（左）、雌性成体（右）及体长测量方法图示
红色箭头所示雄性，黑色箭头所示雌性成体特征
Fig. 1. Characteristics of adult male (left) and female (right) of Tigriopus japonicus and determination of body length
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图 2 不同浓度氨基修饰聚苯乙烯纳米微球（A）及其滤液（B）对日本虎斑猛水蚤14 d存活率的影响
不同字母表示各处理组之间第14 d的存活率存在显著差异（单因素方差分析，p < 0.05）
Fig. 2. Effects on the survival rate of Tigriopus japonicus during the 14 d exposed to amino-modified polystyrene nanospheres (A) and their filtrates (B) at various concentrations
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图 3 不同浓度氨基修饰聚苯乙烯纳米微球（PS-NH2）及其滤液对日本虎斑猛水蚤生长发育的影响
A：猛水蚤从无节幼体发育至桡足幼体（N-C）发育时间，B：猛水蚤从无节幼体发育至成体（N-A）发育时间，C：体长，D：平均蜕皮时间间隔，E：蜕皮组织。C5-A表示猛水蚤从桡足幼体第5阶段发育至成体，C3-C4表示桡足幼体第3阶段发育至第4阶段。*（p < 0.05），**（p < 0.01）和***（p < 0.001）表示处理组与对照组相比存在显著性差异（单因素方差分析）；#（p < 0.05）和##（p < 0.01）表示相同浓度、不同污染物类型处理组之间各个指标存在显著差异（t-检验）
Fig. 3. Effects on the growth and development of Tigriopus japonicus exposed to amino-modified polystyrene nanospheres (PS-NH2) and their filtrates at various concentrations
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图 4 不同浓度氨基修饰聚苯乙烯纳米微球及其滤液对日本虎斑猛水蚤繁殖情况的影响
A：性别比，B：首次产卵时间，C：首次孵化时间，D：孵化次数/10 d，E：每窝孵化幼体数/10 d，F：10 d孵化幼体总数，G：脱落的卵囊部分可孵化幼体，H：脱落的卵囊无法孵化幼体（红色箭头所示为可孵化出幼体，白色箭头所示为无法孵化幼体）。*（p < 0.05），**（p < 0.01）和***（p < 0.001）表示处理组与对照组相比存在显著性差异（单因素方差分析）；#（p < 0.05）和##（p < 0.01）表示相同浓度、不同污染物类型处理组间各个指标的显著差异（t-检验）
Fig. 4. Effects of different concentrations of amino-modified polystyrene nanospheres and their filtrates on the reproduction of Tigriopus japonicus
表 1 慢性毒性实验毒性终点及判断标准
Tab. 1 Toxicity endpoints and their judgment criteria of chronic toxicity test
毒性效应 毒性终点 判断标准 存活效应 存活率/（%） 停止活动，使用吸管触碰后15 s内无反应，头胸与尾部呈直角状[30] 发育效应 发育时间/d 无节幼体−桡足幼体（N-C）时间：猛水蚤发育至桡足幼体第一阶段（C1），身体分为5节，游泳速度明显加快；无节幼体−成体（N-A）时间：猛水蚤发育至成体，其中雄性触角特化成执握器；雌性能够观察到愈合的生殖节[31]（图1） 体长/μm 头部（不含第一触角）至尾叉（不含尾触毛）的长度（图1） 蜕皮次数 — 平均蜕皮时间间隔/d 相邻两次蜕皮发生时间差的平均值 繁殖效应 性别比 雌性个体数量与雄性个体数量之比 产卵时间/d 雌性腹部产生墨绿色卵囊的时间，暴露实验结束时仍未产卵的个体按总暴露时间（24 d）计 孵化时间/d 卵囊孵化出无节幼体的时间，暴露实验结束时仍未孵化幼体的个体按总暴露时间（24 d）计 孵化次数 — 孵化幼体数 — 
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表 2 不同污染物类型（P）和暴露浓度（C）对日本虎斑猛水蚤存活、生长发育和繁殖等方面影响的双因素方差分析结果
Tab. 2 Results of two-way analysis of variance on the effects of different pollutant types (P) and exposure concentrations (C) on survival, growth, development and reproduction of Tigriopus japonicus
影响因素 MSE F P 影响因素 MSE F P 存活率 首次产卵时间 P 42.667 6.024 0.026* P 0.807 3.293 0.088 C 123.389 17.420 < 0.001* C 2.166 8.839 0.001* P*C 5.889 0.831 0.496 P*C 0.983 4.014 0.026* 发育时间（无节幼体至桡足幼体） 首次孵化时间 P 0.844 202.500 < 0.001* P 0.602 0.307 0.587 C 1.115 267.567 < 0.001* C 14.440 7.377 0.003* P*C 0.658 157.967 < 0.001* P*C 4.717 2.410 0.105 发育时间（无节幼体至成体） 孵化次数 P 0.960 288.000 < 0.001* P 0.735 2.075 0.169 C 0.834 250.167 < 0.001* C 1.383 3.904 0.029* P*C 0.761 228.333 < 0.001* P*C 1.245 3.515 0.040* 平均蜕皮时间间隔 每窝孵化幼体数 P 0.010 3.125 0.096 P 69.700 4.324 0.054 C 0.027 8.125 0.002* C 306.148 18.993 < 0.001* P*C 0.012 3.458 0.041* P*C 55.940 3.471 0.041* 体长 孵化幼体总数 P 0.295 0.466 0.505 P 6970.042 1.614 0.222 C 33.355 52.754 < 0.001* C 39209.153 9.082 0.001* P*C 5.221 8.258 0.002* P*C 12152.819 2.815 0.073 性别比 P 2.394 7.183 0.016* C 0.139 0.417 0.743 P*C 0.377 1.130 0.366 注：污染物类型为PS-NH2和PS-NH2滤液；暴露浓度为0 μg/L、5.5 μg/L、55 μg/L和550 μg/L；MSE为均方误差；*表示p < 0.05
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表 3 商品化微纳米塑料及其添加剂组分对水生生物毒性研究
Tab. 3 Toxicity studies of commercialized micro- and nanoplastics and their additive components on aquatic organisms
塑料
粒径/nm聚合物
类型暴露浓度
/μg·L−1暴露
时间/d添加剂成分 受试生物 分离纯化
方式添加剂对微纳米塑料
毒性的影响参考文献 20，200 PS 1×104 2 叠氮化钠（2 mM） 大型溞
（Daphnia magna）透析 添加剂导致PS毒性升高，造成大型溞死亡 [20] 26，100 PS-COOH 1×105 2 吐温-20/SDS
（≤ 0.5%），
叠氮化钠
（26 nm：≤ 0.05%；
100 nm：≤ 0.09%）D. magna
羊角月牙藻
（Raphidocelis subcapitata）透析 添加剂导致PS-COOH毒性升高，造成大型溞与月牙藻死亡 [21] 50 PS 55 21 吐温-20/SDS
（≤ 0.1%），
叠氮化钠
（≤ 0.09%）黑点青鳉
（Oryzias melastigma）离心，
过滤添加剂未产生毒性效应，PS能够导致黑点青鳉仔鱼存活率降低，发育畸形及肝脏损伤 [15] 1000 PS-NH2 550 14 吐温-20/SDS
（≤ 0.1%），
叠氮化钠
（≤ 0.09%）卤虫
（Artemia parthenogenetica）离心，
过滤添加剂以及PS-NH2与添加剂共存时均能够导致卤虫体长降低、发育龄期延迟 [29] 1×105 PS 5.5 4 吐温-20/SDS
（≤ 0.1%），
叠氮化钠
（≤ 0.09%）紫贻贝
（Mytilus galloprovincialis）离心，
过滤添加剂未产生毒性效应，PS能够导致紫贻贝消化小管的厚度变薄，增强活性氧水平，免疫、解毒相关基因表达水平降低 [38] 50 PS-NH2 5.5
55
55024 吐温-20/SDS
（≤ 0.1%），
叠氮化钠
（≤ 0.09%）日本虎斑猛水蚤
（Tigriopus japonicus）离心，
过滤对于存活率、体长、孵化时间和孵化幼体数量等毒性终点，添加剂导致PS-NH2毒性升高；对于发育时间、平均蜕皮时间间隔和产卵时间等毒性终点，添加剂没有产生毒性效应，而PS-NH2则延长了猛水蚤的发育时间、平均蜕皮时间间隔和产卵时间 本研究 注：SDS表示十二烷基硫酸钠
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期刊类型引用(1)
1. 张敏霞，崔艺潇，李昭川，靳非，王莹，崔修鑫，曹硕，丛艺，张明兴，娄亚迪，姚子伟. 结合生态毒性数据和外推模型推导乙二醇的海洋生物水质基准. 生态毒理学报. 2024(06): 21-34 . 
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