The Comparison of different fatty acids extraction methods of marine organism: a case study of Penaeus monodon
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摘要:
本文以海南八门湾斑节对虾为研究对象，通过不同提取方式及转移试剂的结果对比，优化海洋生物样品脂肪酸的前处理方法。实验结果表明：采用微波提取，辅以正己烷和甲醇（含5% HCl）为转移试剂的提取效果优于其他方法，回收率可达到90%以上，且实验步骤简化，提取时间缩短。同时，该方法不会对单个脂肪酸产生选择性影响，可广泛用于海洋生物样品的脂肪酸提取。
Abstract:This paper took Penaeus monodon as the study object to try to optimize fatty acids extraction of marine biological samples by comparing the extracting means and choosing different transfer regents.The results suggested that the method using microwave extraction with n-hexane and methanol (containing 5% HCl) as transfer reagents was the best method.The recovery of this method was higher than 90%.Moreover, the experiment procedure was simplyfied and the extraction time was shortened.Meanwhile, this method had no selective influence on the relative content of individual fatty acids, and could be widely used in the extraction of fatty acids of marine biological samples.
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Keywords:
- Penaeus monodon /
- fatty acids /
- microwave extraction /
- ultrasonic extrection /
- transfer reagents
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海洋生态系统中各个营养级间错综复杂的食物关系增加了能量流动的复杂性，因此，了解能量传递过程是了解海洋生态系统的关键[1]。脂肪酸在食物链能量传递的过程中相对稳定且不易发生变化，在生态学研究中可用于示踪生物的饵料来源。且高等生物体内普遍存在的多不饱和脂肪酸不能通过生物自身合成，故将此类脂肪酸作为特征生物标志物进行海洋食物网营养级的研究已得到国内外的普遍认同[2]。
海洋鱼类脂肪酸的提取方法源于Folch对动物脑脂的提取方法[3]。由于实验条件的限制，不同实验室采取的提取方法各异(如索氏提取，超声提取等)，使用的转移试剂亦种类繁多[4-8]，导致脂肪酸的提取方法尚未统一。近年来随着微波消解仪的普及，微波辅助使有机物的提取更高效，不仅可以减少提取时间，而且提高了回收效率，国内外陆地植物及动物脂肪酸研究中微波提取方法已得到广泛的应用[9-11]。
有研究表明，微波提取方法会对脂肪酸产生一定的影响[12-13]。且微波提取在海洋生物中的应用尚处于起步阶段，将其应用于海洋生物的提取时，需要进一步检验此方法对海洋脂肪酸的提取是否存在选择效应。海洋生物脂肪酸提取方法的标准化，有利于不同海域生物脂肪酸的对比研究，以及海洋食物网长期调查研究的连续性。
本文以海南八门湾斑节对虾为例，通过改变提取方式及转移试剂，对斑节对虾脂肪酸的提取结果进行综合对比分析，得出较优的提取方法，同时研究微波提取方法对斑节对虾脂肪酸产生的影响，为将此方法用于更多海洋生物样品的研究提供帮助。
1 材料与方法
1.1 采样及前处理
斑节对虾购买于2011年6月海南八门湾码头，由当地渔船捕捞获得。称重并测量体长后放入自封袋，于-20℃冷冻保存。返回实验室后，去除头部和外壳，冷冻干燥后，于-80℃冷冻保存，留待后续分析测定。2013年12月进行脂肪酸提取及上机分析测定。
1.2 主要仪器和试剂
气相色谱仪(美国Agilent公司，7890A)。
37 FAMEs(37种脂肪酸甲酯混合标准，Supelco公司)。
甲醇，二氯甲烷，正己烷等有机试剂，均为分析纯(上海凌峰化学试剂有限公司)，二次重蒸后使用。
1.3 实验流程
(1) 脂类提取采用改进后的Folch法[3, 14]。C21:0脂肪酸用做定性内标，C19:0脂肪酸甲酯做定量内标。实验流程如图 1所示：方法1, 2, 3, 4采用传统的超声提取方式，方法5采用微波提取方式，方法6采用先超声后微波提取的方式；同时使用不同的转移试剂，将脂肪酸转移至20mL具塞玻璃瓶中，50℃进行甲酯化[15-16]。12 h后使用正己烷将脂肪酸甲酯转移至4 mL样品瓶中，氮气吹干，加入定量内标19:0脂肪酸甲酯，定容至1 mL，上机。每组实验方法有3个平行样。
(2) 气相色谱分析(GC-FID，美国Agilent公司，7890A)：采用极性毛细管柱DB-FFAP(长30 m，内径0.25 mm，膜厚0.25 um，Agilent，美国)。气相色谱程序升温：初始温度为60℃；以30℃/min的增温速度升至170℃，保持5 min；再以1℃/min的增温速度升至220℃，保持10 min。载气为高纯氮气，流量为1 cm3/min。定性标准为37种脂肪酸甲酯混合标准[14, 17]。
2 结果与讨论
2.1 实验回收率对比
脂肪酸采用如下形式进行表示：CA:Bn-X，A代表碳原子个数，B代表双键个数，X代表第一个双键离甲基端的碳数[18]。本实验利用C21:0脂肪酸做定性内标，C19:0脂肪酸甲酯做定量内标，根据两种标准加入量及气相色谱峰面积，计算各个方法的回收率。
6种实验方法均进行了3组平行样测定。各个实验方法的回收率如图 2所示：在4种超声提取的方法中，方法2的空白及样品的回收率最高，其次为方法3；方法1, 4的空白回收率基本相同，但是方法1的样品回收率明显高于方法4。该结果表明不同的转移试剂会对回收率产生比较大的影响。而方法4与其他实验方法(方法1除外)具有明显差异性(P＜0.05)，该方法采用二氯甲烷和甲醇作为转移试剂，造成回收率低的原因可能是转移试剂为极性试剂，而不同极性的脂肪酸会在两种试剂之间进行重新分配，导致脂肪酸不能有效分离[19]。相对于方法2，方法3的回收率没有提高，反而平行性降低。因此，吹干转移试剂的方法不仅不能提高回收率，还会因为实验步骤的增加而降低实验平行性。因此，通过对比不同的转移试剂的结果，表明正己烷和甲醇(含5% HCl)作为转移试剂的效果最好。
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图 2 不同实验方法的回收率方法1：超声提取，甲醇(含5% HCl)做转移试剂；方法2：超声提取，正己烷和甲醇(含5% HCl)做转移试剂；方法3：超声提取，正己烷和甲醇(含5% HCl)做转移试剂，转移完成后吹干并加入甲醇(含5% HCl)；方法4：超声提取，二氯甲烷和甲醇(含5% HCl)做转移试剂；方法5：微波提取，正己烷和甲醇(含5% HCl)做转移试剂；方法6：先超声后微波提取，正己烷和甲醇(含5% HCl)做转移试剂Fig. 2 The recovery rates of different experimental methods方法5得到的空白和样品的回收率是所有实验组中最高的，将样品的回收率提高到90%以上，明显高于其他实验方法的回收率(P≤0.05)。方法2和6的空白和样品的回收率基本相同。同时，方法2, 5, 6的平行性也基本相同。该结果表明：微波提取能够有效的提高样品的回收率，而且平行性也较好；超声和微波提取相结合的方法并没有明显提高回收率，而且还会增加实验步骤及时间，使过程中的损失增加。因此，采用微波提取并辅以正己烷和甲醇(含5% HCl)作为转移试剂的方法是6种实验方法中回收率及平行性最好的。
表 1 不同方法显著性差异分析Tab. 1 Significant difference analysis in different methods
2.2 不同实验过程对单个脂肪酸影响
表 2所示为单个脂肪酸占总脂肪酸的相对含量，在改变提取方法及转移试剂的过程中，大部分脂肪酸的相对含量基本不变，少数脂肪酸变化较大。同时，部分实验方法中某些含量较少的脂肪酸低于仪器检测限，没有色谱峰的出现。C8:0，C11:0脂肪酸在方法3，4，6中没有出现色谱峰，C23:0脂肪酸在方法1, 3, 4中没有出现色谱峰，方法2, 5的色谱峰最多。该结果说明：增加实验步骤或转移试剂选用不当会增加低含量脂肪酸的损失，导致其低于仪器检测限。方法4的主要脂肪酸的相对含量与其他实验组有较大差异，其他实验组的主要脂肪酸的相对含量基本相同。该结果表明：二氯甲烷和甲醇作为转移试剂会影响脂肪酸的含量，对实验结果产生较大影响。综合单个脂肪酸的影响，方法2, 5对脂肪酸的选择性影响最小，能够更加准确的反映样品真实的脂肪酸组成。
表 2 不同实验过程中单个脂肪酸占总脂肪酸的含量Tab. 2 The percentage of individual fatty acid in total fatty acid of different experimental processes
多种特征脂肪酸的比值可以用于不同食物来源的生物标志物：如∑C16/∑C18，C20:5n-3/C20:4n-6(EPA/ARA)[20-21]。在图 3中发现，方法4，6的∑C16/∑C18与其他实验组有较大差异，实验组3变化范围较大；在EPA/ARA中，方法1, 6与其它组有差异，实验组3变化范围较大，其它三组基本相同。该结果也说明二氯甲烷和甲醇作为转移试剂会影响脂肪酸的含量，同时增加实验步骤会对脂肪酸产生比较明显的影响；而微波提取的方法对脂肪酸的含量及特征脂肪酸比值影响很小[12-13]，不会对脂肪酸进行选择性的影响。
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图 3 不同实验过程中特征脂肪酸比值方法1：超声提取，甲醇(含5% HCl)做转移试剂；方法2：超声提取，正己烷和甲醇(含5% HCl)做转移试剂；方法3：超声提取，正己烷和甲醇(含5% HCl)做转移试剂，转移完成后吹干并加入甲醇(含5% HCl)；方法4：超声提取，二氯甲烷和甲醇(含5% HCl)做转移试剂；方法5：微波提取，正己烷和甲醇(含5% HCl)做转移试剂；方法6：先超声后微波提取，正己烷和甲醇(含5% HCl)做转移试剂Fig. 3 The ratios of characteristic fatty acids in different experimental processes2.3 不同实验方法时间差异
对比上述6种实验方法，超声提取8个样品所需时间是4 h，而微波提取相同数量样品所需时间是1 h。实验组5相对于实验组2, 6分别节约3 h和4 h，同时简化了实验过程。综合考虑回收率、时间及对特征脂肪酸的影响，实验组5是最佳的提取脂肪酸的方法。
2.4 海洋生物脂肪酸提取
Folch脂肪酸提取方法被广泛应用于海洋生物的研究，如浮游生物、鱼类及甲壳类生物[2, 17, 22]。虽然不同实验室选择不同的转移试剂，但是样品回收率基本维持在80%以上。而对于不同生物脂肪酸提取方法，微波消解不会产生明显影响[12-13]。因此，我们以斑节对虾为研究对象的脂肪酸提取方法可以应用于海洋其他生物的研究当中。
3 结论
斑节对虾脂肪酸提取的方法实验表明：采用微波辅助提取，并以正己烷和甲醇(含5% HCl)作为转移试剂，脂肪酸的回收率最高，得到准确完整的脂肪酸信息的同时缩短了提取时间。依据脂肪酸组成信息，可更加全面的进行食物来源分析，从而细化食物链中物质的最初来源，进而更加多元化的分析海洋生态系统当中的食物来源。
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图 2 不同实验方法的回收率
方法1：超声提取，甲醇(含5% HCl)做转移试剂；方法2：超声提取，正己烷和甲醇(含5% HCl)做转移试剂；方法3：超声提取，正己烷和甲醇(含5% HCl)做转移试剂，转移完成后吹干并加入甲醇(含5% HCl)；方法4：超声提取，二氯甲烷和甲醇(含5% HCl)做转移试剂；方法5：微波提取，正己烷和甲醇(含5% HCl)做转移试剂；方法6：先超声后微波提取，正己烷和甲醇(含5% HCl)做转移试剂
Fig. 2. The recovery rates of different experimental methods
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图 3 不同实验过程中特征脂肪酸比值
方法1：超声提取，甲醇(含5% HCl)做转移试剂；方法2：超声提取，正己烷和甲醇(含5% HCl)做转移试剂；方法3：超声提取，正己烷和甲醇(含5% HCl)做转移试剂，转移完成后吹干并加入甲醇(含5% HCl)；方法4：超声提取，二氯甲烷和甲醇(含5% HCl)做转移试剂；方法5：微波提取，正己烷和甲醇(含5% HCl)做转移试剂；方法6：先超声后微波提取，正己烷和甲醇(含5% HCl)做转移试剂
Fig. 3. The ratios of characteristic fatty acids in different experimental processes
表 2 不同实验过程中单个脂肪酸占总脂肪酸的含量
Tab. 2 The percentage of individual fatty acid in total fatty acid of different experimental processes
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