原生动物是海洋浮游食物网中连接经典食物链和微食物环的关键环节^[1]。浮游纤毛虫作为一类重要的海洋原生动物，可作为桡足类重要食物来源，同时其摄食广泛，对水体中的细菌、聚球藻、原绿球藻、硅藻、甲藻、鞭毛虫和纤毛虫等均有摄食^[2-4]。研究自然海区浮游纤毛虫的摄食状况对了解其在海洋浮游生态系统物质循环和能量流动中的作用有重要意义^[2]。

近岸水域浮游植物丰度一般高于远洋，且多以硅藻为优势类群，甚至可以占浮游植物总丰度90%以上^[5-6]，这些硅藻能否通过初级消费者的摄食有效进入食物链流通关系到区域生态系统稳定和资源产出。早期研究认为硅藻主要沿着经典食物链“硅藻-桡足类-鱼类”向上传递，但也有研究指出硅藻会释放有害物质(如不饱和醛类)，特别是在浓度较高时会抑制桡足类生长繁殖^[7]。Saiz和Calbet分析传统方法对桡足类摄食相关研究的历年数据发现仅有约8%的食物来自硅藻^[8]，近年来胡思敏等利用分子生物学方法也发现优势桡足类(如锥形宽水蚤Temora turbinata、亚强次真哲水蚤Subeucalanus subcrassus和微刺哲水蚤Canthocalanus pauper)在自然环境中并未对硅藻进行摄食^[6]，暗示区域浮游食物网中硅藻直接通过桡足类向上传递的效率较低，环境中大量存在的硅藻可能会通过其它路径在食物网中流动。在自然环境中硅藻水华消退会检测到大量原生动物^[9]，室内大规模硅藻培养也时常因原生动物污染而降低产量^[10]，暗示原生动物可能会大量摄食硅藻。那么以纤毛虫为代表的原生动物在自然环境中是否可有效摄食不同粒径的硅藻，进而将硅藻来源的初级生产力向上传递，从而起到对硅藻在食物链中传递的纽带作用？

三亚湾是位于海南岛南部的典型热带近岸海湾，在不同季节，硅藻均是三亚湾浮游植物的绝对优势类群，分别占浮游植物种类数和总丰度的74.0%~90.4%和88.96%~98.07%^[11]。前期运用分子生物学方法研究发现三亚湾桡足类优势种未摄食硅藻^[6]，而稀释培养实验显示湾内微型浮游动物对浮游植物和初级生产力的平均摄食压力分别达到84.56%和177.05%^[12]。纤毛虫作为湾内一类丰度较高、种类多样和功能重要的原生动物^[12-13]，是否在调节三亚湾初级生产力中起到重要作用呢？针对前期三亚湾环境硅藻优势、纤毛虫丰度较高及桡足类对硅藻下行调控能力低的现状^{[6, 12]}，本研究以三亚湾两种优势浮游纤毛虫为研究对象，运用分子生物学技术，检测并分析其对硅藻可能的摄食选择，以期初步揭示近岸硅藻优势海域浮游食物网中硅藻潜在的传递途径和纤毛虫的生态地位，为深入认识近岸生态系统浮游食物网中物质循环途径提供参考资料。

1   材料与方法

1.1   样品的采集

2015年4月24日搭载中国科学院海南热带海洋生物实验站的三亚湾春季调查航次(船号：琼三亚L1109)，在S站(109°26′59" E, 18°12′58" N)进行现场采样(图 1)。

图  1  采样站位

Fig.  1  Sampling location

下载: 全尺寸图片 幻灯片

用Niskin采水器采集表层海水，取500 mL加入样品瓶中，用中性鲁戈氏固定液现场固定，使其终浓度约为2%，用于分析浮游植物的种类及丰度；另取5 L表层海水用中性鲁戈氏固定液现场固定(终浓度约为2%)，避光保存，用于浮游纤毛虫摄食分析。

1.2   样品处理

浮游植物样品沉降浓缩后，取1 mL水样置于Sedgwick-Rafter计数板中在生物显微镜(Olympus BX43)下进行鉴定和计数。

浮游纤毛虫样品带回实验室后，避光静置沉降48 h后浓缩。在体视镜(Olympus SZ61)下挑选出目标种(粒径较小的妥肯丁拟铃虫(Tintinnopsis tocantinensis)(体长70~90 μm)和粒径较大的斯氏拟铃虫(T.schotti)(体长120~130 μm))600只和200只，并将其转移到装有过滤海水(0.22 μm)的玻璃培养皿中。然后先通过玻璃吸管吹打来扰动水体，再在体视镜下用尖头玻璃吸管将样品转移到同样装有过滤海水的培养皿中，反复洗涤多次。之后在体视镜下观察并确认样品表面无杂质后，用解剖针除去砂壳纤毛虫的外壳，用灭菌的过滤海水冲洗干净。最后将洗干净的去壳的目标样品转移到1 mL的细胞计数板中，在生物显微镜(Olympus BX43)下用10倍和40倍的物镜观察其形态并检查是否混有杂质，确定无杂质后转移到装有过滤海水的玻璃培养皿中，在体视镜下分别挑选450只和150只转移至装有0.5 mL过滤海水的1.5 mL离心管中，3000 r/min离心10 min后去上清。在样品中加入DNA裂解液(1% SDS，100 mM EDTA和200 μg/mL蛋白酶K)，超声破碎1 min后，用CTAB法提取目标种DNA^[14]。

使用一对扩增1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基(ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit，rbcL)基因的引物(IDF和IDR)对目标DNA进行扩增，该引物扩增后可获得长度约554 bp的目标序列。该引物主要针对海洋定鞭藻类和不等鞭毛藻类进行特异性的扩增，包括硅藻、金藻、黄绿藻、海金藻、颗石藻、bolidophytes和prynmesiophytes^[15]。将PCR产物进行回收、纯化、克隆等一系列处理，随机挑选若干阳性克隆进行测序(英潍捷基(上海)贸易有限公司)。PCR扩增的条件设置详见表 1。

表  1  PCR扩增控制条件

Tab.  1  Setting conditions of PCR amplification

下载: 导出CSV 

| 显示表格

借助软件Chromas Lite对测序获得的序列进行判读和修正。利用基本局部比对检索工具(basic local alignment search tool, BLAST)在GenBank数据库中寻找目标序列的同源序列。将同源序列中相似度最高的已发表序列与目标序列进行排列比对后(Clustal w1.8)，使用MEGA6.0构建系统邻接树(neighbor joining tree, NJ树)。所选择的核苷酸替代模型为Kimura 2-parameter(重复次数1000)。

2   结果与讨论

2.1   结果

2.1.1   浮游植物群落组成

调查站点浮游植物有22种，总细胞丰度约为3.24×10⁶ cells /L。其中硅藻18种，占到浮游植物总丰度的99.70%，甲藻4种，仅占到浮游植物总丰度的0.30%。硅藻在种类数和丰度上均占绝对优势，其中以尖刺拟菱形藻(Pseudo-nitzschia pungens)和中肋骨条藻(Skeletonema costatum)为优势种，分别占浮游植物总丰度的49.12%和46.78%。

2.1.2   两种砂壳纤毛虫的现场食物组成

本研究共获得79条有效序列，涵盖13种不同的食物类型。其中妥肯丁拟铃虫和斯氏拟铃虫获得有效序列数分别为34和45，分别检测到7和11种食物类型。食物隶属于骨条藻、拟菱形藻、细柱藻(Leptocylindrus)、根管藻(Rhizosolenia)、海链藻(Thalassiosira)、波纹藻(Cymatosira)、星杆藻(Asterionellopsis)和角毛藻(Chaetoceros)。这些检测到的食物类型包括环境中丰度较高的优势种类尖刺拟菱形藻(FM207548.1，93%)和中肋骨条藻(FJ002107.1，96%~99%)，也包括环境中丰度较低的种类，如细柱藻(L.aporus，KC814841.1，96%)等(图 2，表 2)。

图  2  两种砂壳纤毛虫食物多样性

a:送测有效克隆覆盖的种类数；b：基于rbcL序列构建的系统进化树

Fig.  2  Prey diversity of two tintinnid ciliates

下载: 全尺寸图片 幻灯片

表  2  基于rbcL克隆序列在两种砂壳纤毛虫中检测到的浮游植物种类分布

Tab.  2  Taxonomic distribution of rbcL clones retrieved from tintinnid samples

下载: 导出CSV 

| 显示表格

两种砂壳纤毛虫摄食了大量相同的微藻，包括中肋骨条藻(FJ002107.1，96%~99%)、刚毛根管藻(R.setigera，HQ656822.1，97%)、海链藻(T.conferta，HQ710594.1，94%)和细柱藻(KC814841.1，99%)，其中占食物组成最高的为中肋骨条藻(FJ002107.1，96%~99%)，分别占妥肯丁拟铃虫和斯氏拟铃虫总克隆数的85.30%和66.70%，其他3种占各自检出序列总数的比例较少，均在2%~5%之间(表 2)。

两种砂壳纤毛虫对浮游植物摄食也存在差异。其中，妥肯丁拟铃虫还摄食了少量角毛藻(C.dayaensis，KM407460.1，94%)(2.94%)和极小海链藻(T.minima，DQ514797.1，94%)(2.94%)，而并未检测到斯氏拟铃虫对这两种藻类的摄食。斯氏拟铃虫摄食了相当的拟菱形藻(2种)、星杆藻(1种)、波纹藻(1种)、其它细柱藻(1种)、其它根管藻(1种)共5属6种(22.21%)，包括尖刺拟菱形藻(FM207548.1，93%)(13.33%)、伪柔弱拟菱形藻(P.pseudodelicatissima，DQ813817.1，97%)(2.22%)、冰河拟星杆藻(A.glacialis，FJ002115.1，93%)(2.22%)、波纹藻(C.belgica，KJ577891.1，94%)(2.22%)、丹麦细柱藻(L.danicus，KC894148.1，98%)(2.22%)和刚毛根管藻(HQ656822.1，99%)(2.22%)，其中对拟菱形藻类摄食可以达到其摄食硅藻总量的15.55%(表 2)。

2.2   讨论

2.2.1   砂壳纤毛虫的摄食多样性

浮游纤毛虫摄食研究方法主要有体内颗粒法和维持生长法^[2]。应用体内颗粒法在砂壳纤毛虫的食物泡中曾观察到细菌、藻类(甲藻、硅藻、金藻等)、小型浮游动物(鞭毛虫、纤毛虫等)等^[2-4]。但是体内颗粒法操作难度相对较高，对实验技术和科研人员要求较高，并且食物泡中食物的外形较易遭到破坏，鉴定困难。维持生长法是指在实验室内用不同的饵料喂养浮游纤毛虫，依据纤毛虫的生长指标判断其对饵料的摄食状况。此方法虽可以针对性地研究浮游纤毛虫对一种或几种饵料的摄食状况，但其主要针对研究饵料的营养价值，对自然环境纤毛虫摄食多样性难以评价。近年来，分子生物学方法的发展为浮游纤毛虫摄食研究提供了理论和技术支持，另外，随着测序技术的发展，GenBank中收录的不同物种的序列数不断增加，大大提高了检测的宽度和深度。本文选用引物(IDF, IDR)可检测到包括硅藻类、金藻类、黄绿藻和颗石藻类等在内的浮游植物，几乎涵盖了调查站点显微镜检的浮游植物类群，并且引物的有效性已经在桡足类摄食检测的研究中得到了验证^[15]。

前人报道纤毛虫主要摄食微微型/微型生物，很少摄食硅藻^[2-4]。而且以往的研究多依赖于室内已知饵料培养实验、饵料标记或者纤毛虫食物泡的显微鉴定^[2]，很少涉及饵料具体分类。曾祥波等通过对特征色素的检测发现，在硅藻赤潮时，以纤毛虫为主的小型浮游动物对硅藻的现存量摄食压力及生产力的摄食压力可达到45%~71%和56%~165%^[9]，间接说明小型浮游动物摄食是硅藻藻华消退的重要原因^[9]。本研究中两种优势浮游纤毛虫中共检测出8属13种硅藻来源食物，包括骨条藻属、拟菱形藻属、海链藻属、细柱藻属、根管藻属、波纹藻属、星杆藻属和角毛藻属，说明在自然环境中两种拟铃虫对硅藻均有广泛地摄食。其中，骨条藻属、拟菱形藻属、海链藻属是调查站位出现的类群也是拟铃虫常见食物，如Blackbourn在砂壳纤毛虫体内也曾观察到中肋骨条藻^[4]。其余5个属作为拟铃虫饵料鲜有报道，可能与前人使用研究检测方法分辨率不高、调查区域拟铃虫生物量低或饵料丰度较低等原因有关^[4]。比较而言，本研究为自然环境中纤毛虫具有摄食选择性提供了直接证据，拓展了对纤毛虫摄食多样性的认识。

以往对纤毛虫功能的认识偏重于其在微食物环中的重要传递作用^[1]，对初级生产力常认为是通过“浮游植物-桡足类-鱼类”经典食物链进行传递。本研究检测到的两种纤毛虫的硅藻饵料粒径范围约处于0.9~174 μm，其种类和粒径范围跨度均较大(表 2)，说明纤毛虫对初级生产力沿食物链向上传递具有重要的补充作用，也暗示以往研究对纤毛虫生态作用存在一定低估。浮游动物(桡足类)通过对原生动物(如纤毛虫)摄食将微食物环与经典食物链耦合在一起，进而可为初级生产力通过原生动物向上传递提供有效途径^[2]。在研究区域，硅藻可能按“硅藻-纤毛虫-桡足类-鱼类”进行传递，可能为不同粒径硅藻在食物链中的传递提供了重要的驱动力，对近岸生态系统的健康与稳定有重要贡献。

2.2.2   砂壳纤毛虫的摄食选择性

本研究中两种砂壳纤毛虫摄食具有一定的选择性且存在一定的种间差异。自然环境中尖刺拟菱形藻和中肋骨条藻是浮游植物群落中明显的优势种(浮游植物丰度的95.90%)，分别占总浮游植物丰度的49.12%和46.78%。与之对应，妥肯丁拟铃虫和斯氏拟铃虫摄食两者的比例达到85.30%和80%，其中两种纤毛虫摄食的中肋骨条藻比例最高(85.30%, 66.67%)，尖刺拟菱形藻比例明显较低且仅斯氏拟铃虫对其有摄食(13.33%)。在自然环境中，浮游动物摄食行为受多种因素综合影响，其摄食选择性因饵料可获得性及性质(大小、形状、化学性质等)而不同^[2]。根据Blackburn的研究，自然环境中纤毛虫食物液泡中很少观察到硅藻，推测较大个体的藻类可能因为个体太大而无法被纤毛虫摄食^[4]。砂壳纤毛虫能够摄食的饵料粒径往往受壳室口径大小的限制，摄食的最大食物粒径约为其壳室口径的60%~80%^[16]，因此纤毛虫壳室口径愈大，其可能摄食的食物粒径范围越宽。相同的摄食环境中，粒径较大的斯氏拟铃虫(口径约90~98 μm)摄食多样性略高于粒径较小的妥肯丁拟铃虫(口径约17~25 μm)，可能与其壳室的口径的大小有主要关系。而且，饵料的质量(如化学性质)会影响纤毛虫对物质的获取，同时饵料的营养价值(如脂肪酸含量)、毒性(有无)等也会影响浮游动物摄食^[17-18]。

研究海域中有丰富的中肋骨条藻，其丰度占水体中浮游植物总丰度的46%以上(仅次于尖刺拟菱形藻)，对于摄食生物而言，是较易获得的食物来源。三亚湾桡足类摄食的研究中，没有发现优势桡足类(如锥形宽水蚤、亚强次真哲水蚤和微刺哲水蚤)对其有摄食作用^[6]。本研究发现，中肋骨条藻是这两种砂壳纤毛虫重要的饵料，在克隆文库中占有相当的比例，虽然不能在摄食量层面进行探讨，但此结果仍提示砂壳纤毛虫在近岸生物群落中对其有一定的下行控调控作用。有研究报道硅藻的长须是影响砂壳纤毛虫摄食硅藻的重要因素，通常长有长须的硅藻不容易被摄食^[19-20]。中肋骨条藻通常不具长须，细胞直径在6~7 μm之间，而且有报道指出中肋骨条藻是浮游生物最喜爱的食物之一^[21]。因此，就中肋骨条藻的丰度、粒径/形状、质量而言，均为此次调查的纤毛虫合适的饵料。

拟菱形藻在水体中丰度最高，却仅在斯氏拟铃虫食物中检测到并且比例较低，这与前人报道拟铃虫对拟菱形藻摄食比例较低的结果相似^[18]。本研究中检测到作为食物的浮游植物粒径均不超过200 μm，且尖刺拟菱形藻和伪柔弱拟菱形藻个体不小于50 μm。从粒径的角度来看，粒径较大的拟菱形藻不易被本调查中两种纤毛虫直接摄食，尤其是粒径较小的妥肯丁拟铃虫。本研究中检测到的拟菱形藻可能来源于衰败降解的碎屑或其它浮游动物不完全摄食作用遗留的组织碎屑^{[2, 22]}。曾祥波等研究发现浮游动物对拟菱形藻摄食比例较低，可能是由于生物对其存在一定的避食行为^[23]。与其他丰富的硅藻(如Thalassiosira spp.)相比，拟菱形藻具有毒性和细胞含碳量较低^[18]。因此，捕食者为了在消耗同样数量的碳源时获得更多能量及逃避毒素等原因，可能会减少对拟菱形藻的摄食^[18]。此外，摄食拟菱形藻会限制捕食者某些特殊功能，与其他微型浮游动物相比，拟铃虫生物量与拟菱形藻摄食率不相关^[18]，说明拟菱形藻对其生长繁殖贡献不大。因此，虽然拟菱形藻是浮游植物中最丰富(丰度为49.12%)的，却是拟铃虫不太理想的食物，这可能也是造成拟菱形藻被本研究中两种优势纤毛虫摄食比例较小的原因。

2.2.3   生态意义

相比中型浮游动物，纤毛虫具有较高的生长率和摄食率，它们对环境变化的响应快，对维持海洋近岸生态系统的稳定健康有重要意义。三亚湾纤毛虫相对丰富，其平均丰度在310~600 ind./m³ 之间^[12]，而且其中一个站位就发现了79个来自纤毛虫OTUs^[13]。同时硅藻是三亚浮游植物的绝对优势类群，其物种数量和细胞丰度方面均占优势^{[6, 11]}，本次采样站位浮游植物的组成以硅藻占绝对的优势(丰度99.70%，种类数81.82%)。虽然前人显微镜检发现纤毛虫食物泡中硅藻较少^{[2, 4]}，但本研究运用分子生物学检测技术显示纤毛虫具有多样化的硅藻食物来源。自然海域纤毛虫丰度较高，且能对种类广泛的硅藻进行摄食，增强了其与不同粒径硅藻之间的相互作用，暗示了硅藻对自然环境中的纤毛虫的生长和繁殖具有重要的贡献。在硅藻优势的海域，纤毛虫可能是硅藻在食物链传递中的重要驱动力和重要环节，这对于近岸生态系统的健康稳定和近岸生态系统的物质产出均具有重要意义。

3   结论

(1) 调查站点的浮游植物主要以硅藻为主，占浮游植物总丰度的99.70%。

(2) 自然环境中，斯氏拟铃虫和妥肯丁拟铃虫对硅藻摄食广泛，共检测出8属13种硅藻来源的食物，其中均以骨条藻检出频率最高(>60%)。

(3) 粒径较大的斯氏拟铃虫摄食多样性(11种)略高于粒径较小的妥肯丁拟铃虫(7种)，二者存在一定的摄食选择性和种间摄食差异。