Response of Phaeodactylum tricornutum to different phosphorus stress and recovery in batch culture
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摘要:
采用批次培养，设置5个PO4-P浓度（0 μmol/L，0.566 μmol/L，2.26 μmol/L，9.05 μmol/L，36.2 μmol/L）进行实验，并从第9 d开始进行2 d恢复实验，研究三角褐指藻在不同磷胁迫压力及恢复下的响应。测定参数包括PS Ⅱ的最大光能转化效率（Fv/Fm）、PS Ⅱ的实际光能转化效率Y（Ⅱ）、光合电子传递效率（ETR）及藻密度。结果发现：磷胁迫对藻密度、Fv/Fm、Y（Ⅱ）和ETR有显著影响。恢复实验中，Fv/Fm、Y（Ⅱ）、ETR等恢复速率与起始所受磷胁迫程度以及再添加的磷浓度呈正相关。与藻密度相比，Fv/Fm、Y（Ⅱ）、ETR等荧光参数可以在12 h内产生更显著的变化。本实验表明，在严重的磷胁迫条件下，磷的输入可以造成藻类的补偿生长；在小时尺度上叶绿素荧光参数随磷胁迫程度可以迅速做出响应。
Abstract:Five concentration of PO4-P (0, 0.566 μmol/L, 2.26 μmol/L, 9.05 μmol/L, 36.2 μmol/L) were set up to study the response to different phosphorus stress and recovery in batch culture.Fv/Fm, Y (Ⅱ), ETR and biomass was measured.Phosphorus was not added until the ninth day during ten-day experiments.Results showed that the concentration of phosphorus has a significant influence on biomass, Fv/Fm, Y (Ⅱ) and ETR.The recovery rates of Fv/Fm, Y (Ⅱ) and ETR were positively correlated with the initial and the added phosphorus concentrations.Overall, the input of phosphorus can cause compensatory growth in the severe phosphorus stress, and the chlorophyll fluorescence parameters can respond quickly within 12 h.
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海洋藻华，以前多称“赤潮”，是一种严重的海洋生态灾害。随着经济的发展，大量废水被排入海，导致我国海域水质下降，灾害频发，经济损失严重[1-2]。藻华是一系列复杂的海洋学和生态学过程，是各种环境因素综合作用的结果。营养物质作为生物生长的限制因素，在藻华形成中有非常重要的作用[3-5]。氮、磷是限制藻生长的重要因子，过低或过高都会对藻类生长产生重要影响。近年来营养盐污染不断加剧，氮输入量增加但磷输入量减小，N/P比大致呈逐年增加趋势，P成为近年来渤海湾限制浮游植物生长的重要因子[6]。
叶绿素荧光技术基于光合作用理论，运用叶绿素作为天然探针来研究植物光合生理状况和环境因子对其细微影响。与传统藻类参数相比具有快速、准确、不破坏细胞、需要样品少、测量方法简单等优点。国内外很多研究测量了外界因子对藻类的叶绿素荧光参数的影响[7-9]，测量主要参数包括：Fv/Fm、Y (Ⅱ)和ETR等。越来越多的研究表明丰富的光合作用信息是由植物体内叶绿素荧光信号发出的[10]，其变化特点与外界环境条件相关，可以探测胁迫下植株光合作用的真实行为，评价光合机构的功能和环境胁迫的影响[10-11]。
目前不少学者研究了不同微藻对环境因子的响应[12-15]，主要集中在以天为尺度营养盐对微藻的影响上，在更小的时间尺度上研究较少。叶绿素荧光仪可以快速准确的测定各荧光参数，故可利用叶绿素荧光技术研究短时间内胁迫对藻类的影响。
1 材料与方法
1.1 实验设计
实验选用我国渤海代表藻种三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)作为研究对象进行批次培养，磷浓度作为实验研究的变量，其他因素如pH对实验结果影响较小可忽略。实验分为5个浓度水平(0，0.566，2.26，9.05，36.2 μmol/L)，每个浓度设置3个平行组。实验进行10 d，从第9 d开始把每个浓度组分为两组处理，一组进行磷恢复输入(36.2 μmol/L)，另一组为重复输入，如表 1。各荧光参数在光照下每2 h测一次，黑暗下每3 h测一次；每天记录藻密度。
表 1 PO4-P的添加方式Tab. 1 The modes of phosphate supplyPO4-P添加方式/μmol·L-1 A组 B组 C组 D组 E组 第1 d输入磷浓度 0 0.566 2.26 9.05 36.2 第9 d (磷重复输入) 0 0.566 2.26 9.05 36.2 第9 d (磷恢复输入) 36.2 36.2 36.2 36.2 36.2 1.2 藻种接种及培养
将三角褐指藻(硅藻门，羽纹纲，褐指藻目，褐指藻科，褐指藻属)在光照培养箱内培养，温度20±1℃，光照强度110 μmol/m2/s，光照周期L:D=12:12。选用f/2改良培养基[16]，人工海水(AW)参考人工海水介质[17]。每5 d转接一次，重复2次。实验前将处于指数增长期的藻液离心(3000 r/min)，离心后转入无磷培养基中饥饿培养3 d。将饥饿的藻种离心10 min，弃掉上清液，用无菌人工海水洗涤后再离心，重复3次。实验在1000 mL锥形瓶中进行，取藻液接种到400 mL培养基中，初始接种密度为2×104/mL。每个实验组设置3个平行，每天摇动3~4次[18]。
1.3 叶绿素荧光参数的测定
采用水样叶绿素荧光仪(Walz, Effeltrich, Germany)进行荧光参数的测定。光照条件下每2 h测量；黑暗下每3 h测量。测量前将藻样暗适应15 min，暗适应结束后对Fv/Fm、Y(Ⅱ)、ETR进行测定并记录。
1.4 藻细胞密度的测定及比生长率计算
采用血球计数板计数，每天同一时间取样并在生物显微镜下检测藻密度。比生长率计算公式：μ=(lnX2-lnX1)/(T2-T1)。式中：X2为某一时间间隔终结时的藻类现量；X1为某一时间间隔开始时的藻类现量；T2-T1为某一时间间隔。
2 结果与讨论
2.1 不同磷浓度对藻密度的影响
前8 d，从图 1中可以看出不同的磷浓度造成了不同程度的磷胁迫，不同磷胁迫下增长曲线有所差异，藻密度随磷胁迫程度的增大而减小。A、B组在8d内的增长不明显，C、D、E 3组在第5 d进入对数增长期。D、E两组藻密度相差不大，C组与D、E两组差别较大。
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图 1 磷再次输入后藻密度的变化曲线(a图为磷重复输入后藻密度的变化曲线，b图为磷恢复输入后藻密度的变化曲线)Fig. 1 The density curve of Phaeodactylum tricornutum after re-added PO4-P第9 d再次输入PO4-P，两种输入方式产生了不同的影响。当重复输入与初始实验相同浓度的磷，发现B、C、D、E 4组的藻密度有明显增加，E组第10 d藻密度达到4.61×106/mL (图 1a)。磷恢复培养后可以看出实验组的藻密度均明显增加(图 1b)，第10 d的藻密度增长速度大于第9 d。从藻密度总量看C组在恢复添加后最大，达到了4.83×106/mL，其次为E组4.62×106/mL。恢复培养后第10 d比生长率最大为C组，C、B、A 3组的比生长率都超过了E组。两种输入方式相比，恢复输入的A、B、C 3组的比生长率与重复输入相比显著增大，D组不显著(图 2)。
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图 2 磷再次输入后第10 d的比生长率Fig. 2 Growth rate of Phaeodactylum tricornutum after re-added PO4-P on the tenth day2.2 不同磷浓度对叶绿素荧光参数的影响
在前8 d内，由图 3、4、5中可以看出，各组随磷胁迫程度的增加，Fv/Fm、Y(Ⅱ)、ETR的值逐渐减小。由于不同浓度造成的胁迫压力不同，导致A、B、C 3组下降明显，D、E两组基本保持稳定。光照条件和黑暗条件相比有较大的差异，前8 d，光照条件下3个参数的值总体上大于黑暗条件。
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图 3 不同磷浓度对三角褐指藻Fv/Fm的影响Fig. 3 Effects of different PO4-P concentration on Fv/Fm of Phaeodactylum tricornutum![]()
图 4 不同磷浓度对三角褐指藻Y(Ⅱ)的影响Fig. 4 Effects of different PO4-P concentration on Y(Ⅱ) of Phaeodactylum tricornutum![]()
图 5 不同磷浓度对三角褐指藻ETR的影响Fig. 5 Effects of different PO4-P concentration on ETR of Phaeodactylum tricornutum8 d后A组重复加入0浓度的磷，第10 d藻种的Fv/Fm值已经下降到0.35左右，说明此时三角褐指藻已受到了严重的磷胁迫。但A组恢复添加后Fv/Fm值有明显的增大从0.380恢复到0.658，说明藻种受到的胁迫伤害是可逆的。B组重复输入后Fv/Fm、Y(Ⅱ)、ETR值有所增加，但没有达到第1 d的水平；而恢复输入2 d后A、B两组值达到第1 d的水平。比较两种添加磷的方式，A、B两组恢复输入Fv/Fm、Y(Ⅱ)、ETR值显著大于重复输入，C、D两组没有显著差别。在光照和黑暗条件下，两种输入方式对Fv/Fm有显著影响，重复输入时光照和黑暗的Fv/Fm的差值与恢复培养相比更大。E组作为正常浓度组可用作对照，可发现磷再次加入后Fv/Fm、Y(Ⅱ)、ETR值没有明显改变。
2.3 讨论
本实验发现藻密度随磷胁迫的减小而增加，但D、E组相差不大。重复输入后除A组外，其他4组藻密度明显增加。观察第10 d比生长率可发现E组最大，D组其次，A组最小。恢复培养后各实验组比生长率大于对应的重复输入后的比生长率。B、C两组的比生长率大E组，A、D两组接近E组。
浮游植物在不同的营养盐浓度中存在3种生理响应策略：生长策略、亲和策略和储存策略[19]。三角褐指藻有较高的生长率是典型的生长策略者。作为生长策略者在营养盐浓度增加时会迅速吸收来供给生长。由图 1可以看出无论重复输入还是恢复输入藻密度都随磷浓度的突然增加而增大。周慧敏等人发现在特定重复频率下藻密度有较大波动，并且波动周期与磷酸盐添加周期大致相关[20]，与本文实验结果相似。张小兵等人发现部分藻种在环境胁迫下存在补偿生长[21]。一旦环境胁迫解除，藻类的生长就出现补充甚至超出对照组的现象。补偿现象发生的影响因素包括限制程度，限制时间，补偿期条件，营养物质性质及生物体性成熟程度。本实验A、B、C 3组在第10 d的比生长率超过对照组E，发生了超补偿现象。D组与E组相差不大，发生了补偿现象。对于三角褐指藻，由于A、B、C 3组胁迫程度较大，更易发生超补偿现象。恢复输入具有更大的藻密度，是因为作为生长策略者恢复输入的磷浓度更高，补偿期条件更好。由此可推测在贫磷状态下，磷酸盐的再输入对藻类生长有极大的促进作用，可能会引起藻华爆发。
浮游植物吸收的光能主要分成3部分：叶绿素荧光，热耗散以及光合作用。因为光能的吸收是固定的，以上3个过程此消彼长，光合作用的变化便会引起叶绿素荧光的相应变化。因此叶绿素荧光参数的变化可以反映出外界因子对光合作用的影响。Fv/Fm反映PSⅡ的最大光能转换效率，非胁迫条件下该参数的变化极小，而在胁迫条件下明显下降。Y(Ⅱ)反映了PSⅡ反应中心在胁迫环境中有部分关闭情况下的实际原初光能捕获效率，以及实际的PSⅡ光化学反应的效率。ETR表示PSⅡ的表观电子传递速率。
实验第1 d，各浓度组Fv/Fm均达到0.65，说明三角褐指藻处于生长正常状态，经饥饿后藻细胞并没有完全消耗细胞内储存的磷。A、B、C 3组受到了较严重的磷胁迫，D、E两组磷相对充足；A、B、C 3组Fv/Fm、Y(Ⅱ)、ETR下降明显，D、E两组不明显。磷是植物生长发育的必需元素，作为底物或调节物直接参与光合作用，包括光能吸收、同化力的形成、卡尔文循环、同化产物的运输以及对一些关键性酶的活性起调节作用，参与植物生长发育过程中的各种代谢活动[22]。磷胁迫使光合磷酸化水平降低，光合速率下降，NADP+和NADPH的再生循环受抑制。由于NADP+是光合电子传递PSⅠ端的最终电子受体，其供应量不足，会引起PSⅡ功能下降。低磷导致藻种PSⅡ受到严重伤害，光合作用原初反应受到抑制，严重阻碍了电子传递，导致PSⅡ电子传递活性降低，故3组参数下降。研究发现将三角褐指藻放在缺P的条件下培养4 d，Fv/Fm显著降低。再次加磷24 h后测定Fv/Fm，发现该参数恢复到营养盐充足时的水平[23]。本实验在恢复输入6 h后A、B、C 3组Fv/Fm基本恢复到正常水平，发现在更短的时间内监测到了荧光参数的变化。与之前的研究相比本实验中有D、E两组没有恢复到正常水平，推测其原因可能是：前8 d磷胁迫并没有将光系统完全破坏，A、B、C 3组加入充足的磷后，作为生长策略者三角褐指藻将其迅速吸收，而D、E两组胁迫较小，由于实验时间的限制相关参数没有恢复到正常水平。原始光能转化效率提高，反应中心QA被氧化数量增多，电子传递速率相对增加，ATP的合成有了物质来源，叶绿素荧光参数随之增大。可以推测胁迫压力越大，再次添加限制性营养盐后，反应越迅速，对恢复的响应越快。
黑暗相当于长时间暗适应，研究发现暗适应时间不同叶绿素荧光参数会有显著的差异。几分钟的暗适应可以氧化质体醌等，但长时间的暗适应不但能耗尽呼吸基质，也会消耗掉ATP和跨膜离子浓度梯度，使Fv/Fm、Y(Ⅱ)、ETR等参数降低[24]。实验后期黑暗状态的参数越来越小，推测暗适应时间过长与磷胁迫的共同作用。
对比藻密度和荧光参数的变化速率可以发现：再次添加PO4-P后，叶绿素荧光参数在12 h之内发生了明显变化，而藻密度和比生长率在短时间内变化不明显。王昭玉等人发现营养盐限制的藻体在重新添加限制性营养盐后，与对照组相比Fv/Fm在5~24 h之内便开始显著升高，可以把Fv/Fm作为判断限制因子的指标[25]。结合本实验相关叶绿素荧光参数也可以迅速检测水体中某些藻类的生长状况，为了解藻类生长状态和有害藻华的预防提供帮助。
3 结论
(1) 磷胁迫程度对藻密度及Fv/Fm、Y(Ⅱ)、ETR有显著影响。磷浓度越低，藻密度的增长速率越小。再次恢复添加磷后，磷浓度为0、0.566 μmol/L、2.26 μmol/L的实验组发生了超补偿生长。
(2) 8 d后各实验组Fv/Fm值下降至0.4左右，藻种PSⅡ受到严重伤害。再次加入磷后，荧光参数随磷浓度的变化有不同程度的增加。
(3) 研究结果表明，三角褐指藻起始所受磷胁迫越大、再添加的磷浓度越大，Fv/Fm、Y(Ⅱ)、ETR恢复速率越大。Fv/Fm、Y(Ⅱ)、ETR对磷胁迫的响应迅速，可作为潜在的藻华预警指标。
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图 1 磷再次输入后藻密度的变化曲线
(a图为磷重复输入后藻密度的变化曲线，b图为磷恢复输入后藻密度的变化曲线)
Fig. 1. The density curve of Phaeodactylum tricornutum after re-added PO4-P
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图 2 磷再次输入后第10 d的比生长率
Fig. 2. Growth rate of Phaeodactylum tricornutum after re-added PO4-P on the tenth day
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图 3 不同磷浓度对三角褐指藻Fv/Fm的影响
Fig. 3. Effects of different PO4-P concentration on Fv/Fm of Phaeodactylum tricornutum
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图 4 不同磷浓度对三角褐指藻Y(Ⅱ)的影响
Fig. 4. Effects of different PO4-P concentration on Y(Ⅱ) of Phaeodactylum tricornutum
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图 5 不同磷浓度对三角褐指藻ETR的影响
Fig. 5. Effects of different PO4-P concentration on ETR of Phaeodactylum tricornutum
表 1 PO4-P的添加方式
Tab. 1 The modes of phosphate supply
PO4-P添加方式/μmol·L-1 A组 B组 C组 D组 E组 第1 d输入磷浓度 0 0.566 2.26 9.05 36.2 第9 d (磷重复输入) 0 0.566 2.26 9.05 36.2 第9 d (磷恢复输入) 36.2 36.2 36.2 36.2 36.2 
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