近年来，鱼毒性藻类赤潮(Ichthyotoxicity Algae Blooms, IABs)在我国沿海频繁发生，对我国沿海水产养殖业造成巨大损失。2012年，福建沿海发生由米氏凯伦藻引起的鱼毒性藻类赤潮，造成高达20亿元的经济损失^[1]。鱼毒性藻类对鱼类的致毒物主要为溶血毒素(hemolytic toxin)和活性氧(ROS)^[2-3]及其它有毒物质^[4]。溶血毒素主要通过改变磷脂双分子层的通透性使血红细胞膜结构发生变化，进而造成细胞溶解。溶血毒素的溶血作用与洋地黄皂苷类似，洋地黄皂苷能与细胞膜上的胆甾醇形成复合物，使细胞膜去稳定化，导致细胞溶解，从而引起溶血^[5-6]。鱼毒性赤潮现场调查和受害鱼类病理切片观察发现，受害的鱼鳃表面有大量出血，鱼腮表面细胞脱落和血细胞溶解破裂^[7]。研究发现，我国沿海主要的鱼毒性藻类细胞大多含有高浓度的超氧化物和溶血毒素^[8-9]，这两者都会导致鱼鳃组织损伤，可能是引起鱼类死亡的重要因素。因不同种类鱼毒性藻类的毒性受环境因素影响较大，本文选用海洋青鳉鱼为受试物，以过氧化氢、洋地黄皂苷分别为活性氧和溶血毒素的替代物，研究鱼毒性藻类对鱼类的致毒作用和方式，为进一步阐述鱼毒性藻类对鱼类的致害机理提供支持。

1   材料与方法

1.1   实验材料

1.1.1   实验试剂和仪器设备

洋地黄皂苷(纯度为53.83%，日本J & K公司)，过氧化氢(AR，广州化学试剂厂)，氯化钠(AR，广州化学试剂厂)，柠檬酸钠(AR，广州化学试剂厂)，葡萄糖(AR，天津化学试剂一厂)，磷酸二氢钾(AR，广州化学试剂厂)，磷酸二氢钠(AR，广州化学试剂厂)，氯化钾(AR，广州化学试剂厂)，曝气泵(无锡永久)，酶标仪(美国伯乐)，新鲜兔血红细胞溶液(0.5%，取自新西兰兔耳缘静脉)。

1.1.2   海洋青鳉鱼

受试生物海洋青鳉鱼购于香港城市大学国家海洋污染重点实验室。运回后，先于预先曝气的海水中驯养5 d，实验前2 d停止喂食。挑选活力强，体重20±2 mg，体长20±2 mm，60日龄的健康鱼用于实验。

水质参数：ρ(DO)>6.0，pH为7.8±0.2，盐度为25~28，水温为21±1℃。

1.2   实验方法

1.2.1   过氧化氢毒性实验

配制不同浓度的过氧化氢溶液，与预先曝气的海水充分混匀，待用。分别设置过氧化氢的浓度为5、7.5、10、15、20、30、45、70、100、150 mmol/L。以不加过氧化氢为对照，设置3个平行。

1.2.2   洋地黄皂苷毒性实验

使用预先进行曝气处理的海水配置不同浓度的洋地黄皂苷溶液，正式实验前进行预实验，先确定洋地黄皂苷对海洋青鳉鱼的效应区间，然后确定实验浓度。正式实验时洋地黄皂苷的浓度分别为0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、2.75、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12 μg/mL。以不加洋地黄皂苷为对照，每组设置5个平行。

1.2.3   过氧化氢和洋地黄皂苷的联合毒性实验

联合毒性实验采用等毒性配比法^[10]。等毒性单位指在联合毒性作用下受试物的浓度与单一毒性实验时该受试物LC₅₀的比值。考虑到两种作用物的联合作用效应存在多种可能，故其浓度的设置按等毒性单位相似比例设置，如第一组两种作用物的浓度对数均为其LC₅₀对数的15%，第二组约为20%，各组比例依此增加。过氧化氢和洋地黄皂苷的浓度分别设置为：21 mmol/L+0.2 μg/mL、31 mmol/L+0.3 μg/mL、42 mmol/L+0.4 μg/mL、52 mmol/L+0.5 μg/mL、73 mmol/L+0.7 μg/mL、94 mmol/L+0.9 μg/mL、114 mmol/L+1.1 μg/mL。以不加过氧化氢和洋地黄皂苷为对照，每组设置3个平行。

参照文献鱼类毒性暴露实验方法^[11-12]，设置上述实验的暴露体积为500 mL，在烧杯中进行，每个烧杯中放10尾鱼。实验中判断青鳉鱼死亡以腮部停止活动，且用玻璃棒轻触其尾柄部位，30 s内无反应为准。

1.3   数据处理

在过氧化氢和洋地黄皂苷的单一毒性实验和联合毒性实验中，一般要求对照组不出现死亡。如果对照组发生偶然死亡，则参照文献^[13]对各浓度的死亡百分数进行校正，公式如下：

式中：P₁表示实验观察组死亡百分数；C表示对照组死亡百分数；P表示较正后的死亡百分数。

溶血百分数的计算参照Eschbach等^[14]的方法，具体公式如下：

式中：E₄₁₄表示所测样品吸光度；A₄₁₄表示阴性对照吸光度；N₄₁₄表示海水吸光度；P₄₁₄表示阳性对照吸光度；P₀表示溶血百分数。

溶血百分数与几率单位换算参照文献^[13]中的方法。根据溶血百分数与几率单位换算表，可以得出洋地黄皂苷的浓度对数与死亡几率的关系。

运用Excel、Spss与Sigmaplot进行数据处理并作图。

2   结果与讨论

2.1   过氧化氢对海洋青鳉鱼的毒性实验

海洋青鳉鱼在过氧化氢中的半致死浓度(LC₅₀)与其暴露时间之间的关系如表 1所示。从表中可知，海洋青鳉鱼在过氧化氢中暴露1 h的LC₅₀为144.5 mmol/L。通过表 1建立半致死浓度(y)与过氧化氢作用时间(x)的函数方程为：y=1539·e^-2.44x(R²=0.99，P＜0.01)，式中y为半致死浓度，x为暴露时间。

表  1  海洋青鳉鱼在过氧化氢中的半致死浓度(LC₅₀)与暴露时间之间的关系

Tab.  1  Relationship between LC₅₀ and exposure time of O.melastigma exposed to hydrogen peroxide

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过氧化氢对青鳉鱼的半致死浓度(LC₅₀)与其暴露时间之间的曲线如图 1所示。从图中可知，当暴露时间小于2 h时，其LC₅₀随时间急剧降低，超过2 h后，其LC₅₀降低趋势减缓。

图  1  青鳉鱼在过氧化氢中的半致死浓度(LC₅₀)与暴露时间的关系曲线

Fig.  1  Exposure time-LC₅₀ curve of O.melastigma exposed to hydrogen peroxide

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2.2   洋地黄皂苷对海洋青鳉鱼的毒性实验

海洋青鳉鱼在洋地黄皂苷中的半致死浓度(LC₅₀)与其暴露时间之间的关系如表 2所示。从表中可知，青鳉鱼在洋地黄皂苷中1 h的LC₅₀为1.25 μg/mL。通过表 2建立半致死浓度(LC₅₀)与暴露时间的函数方程为：y=17.86·e^-0.0625x+0.70(R²=0.99, P＜0.01)，上式中x表示暴露时间，y表示半致死浓度。

表  2  海洋青鳉鱼在洋地黄皂苷中的半致死浓度(LC₅₀)与其暴露时间的关系

Tab.  2  Relationship between LC₅₀ and exposure time of O. melastigma exposed to digitonin

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洋地黄皂苷对青鳉鱼的半致死浓度(LC₅₀)与其暴露时间的曲线如图 2所示。从图中可知，二者呈现出良好的指数关系。当测定鱼毒性藻类毒性时，可以根据半致死时间参照图 2确定其对鱼类的毒性大小。

图  2  青鳉鱼在洋地黄皂苷中的半致死浓度(LC₅₀)与其暴露时间的曲线

Fig.  2  Exposure time-LC₅₀ curve of O.melastigma exposed to digitonin

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由于单位体积鱼毒性藻类对鱼类的毒性受环境和浓度等因素影响较大，为便于介定不同鱼毒性藻类水体的毒性，依据上述实验结果，引入鱼单位(fish unit, FU)，1FU定义为将一条60日龄、重20 mg的海洋青鳉鱼暴露于洋地黄皂苷溶液中并在0.5 h死亡的浓度。由图 2可知，1 FU为洋地黄皂苷浓度3.44 μg/mL。

2.3   过氧化氢与洋地黄皂苷对海洋青鳉鱼的联合毒性实验

过氧化氢和洋地黄皂苷对海洋青鳉鱼单一和联合作用的半致死浓度见表 3。当过氧化氢和洋地黄皂苷联合作用于青鳉鱼时，过氧化氢浓度对数(x)与青鳉鱼死亡几率单位(y)的函数关系为：y=3.9x-1.76(R²=0.95, P＜0.01)，LC₅₀为53.7 mmol/L。洋地黄皂苷浓度对数(x)与青鳉鱼死亡几率单位(y)的函数关系为：y=3.95x+6.12(R²=0.95, P＜0.01)，LC₅₀为0.52 μg/mL。

表  3  过氧化氢与洋地黄皂苷对海洋青鳉鱼单一和联合作用的LC₅₀

Tab.  3  LC₅₀ of O. melastigma exposed to single and combined hydrogen peroxide and digitonin

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分别使用相加指数法^[15]、毒性单位法^[16]、相似性参数法^[17]和混合毒性指数法^[18]对过氧化氢和洋地黄皂苷的联合毒性实验结果进行分析评价，结果如表 4所示，4种方法评价结果都表现为两者对鱼类的致毒效应为协同作用。

表  4  过氧化氢和洋地黄皂苷对海洋青鳉鱼联合致毒作用分析

Tab.  4  Joint toxic effect of hydrogen peroxide and digitonin on O. melastigma

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2.4   讨论

超氧化物是细胞产生的一类防御性物质，在清除自身有害代谢产物及外来污染物中发挥重要作用，通常在光合系统光合放氧阶段或线粒体中产生，正常情况下细胞中都存在低量这类物质，但研究表明，海洋卡盾藻、米氏凯伦藻和赤潮异湾藻等鱼毒性藻类细胞均含有超量的ROS^[19]，其原因不明。超氧化物在致鱼类毒害中的作用尚不清楚。Kwok等^[4]认为藻类产生的ROS不足以导致鱼类死亡，Tang等^[2]发现金线鲤暴露在过氧化氢和卡盾藻液中的死亡机制不同，认为过氧化氢不是导致鱼类死亡的主要原因，Woo等^[20]也证实了活性氧不是导致鱼类死亡的主要原因，Dorantesaranda等^[21]发现超氧化物与鱼鳃细胞活力之间没有明显的关系，超氧化物仅部分参与到鱼毒性作用中。本文在过氧化氢单一毒性实验过程中发现，青鳉鱼暴露在高浓度的过氧化氢中会出现抽动、冲撞、惊厥等症状，高浓度下的鱼死后漂在水面，身体逐渐僵硬并且表面出现很多水泡，初步判断为过氧化氢的氧化作用所致。对鱼鳃进行解剖发现鱼鳃没有溶血现象，但鳃丝和鳃弓呈暗黑色，类似焦灼。过氧化氢对海洋青鳉鱼1 h的LC₅₀为144.5 mmol/L，远高于海洋卡盾藻藻液中过氧化氢的浓度^[22]，推测鱼毒性藻类的超氧化物对鱼类的致害作用有限，但通过与溶血性物质的联合致毒实验发现，两者具有协同作用，提示鱼毒性藻类高含量的超氧化物可协同藻类中其它毒素对鱼类产生致害，这能很好地解释某些鱼毒性赤潮在光强和温度较高时鱼类的死亡率会大幅升高的现象。

研究表明，现有的鱼毒性藻类都有溶血活性。尽管这类溶血活性物质的化学结构成分不同，但大多为糖脂类物质，其对血红细胞的作用机理相似，对鱼鳃丝的损害作用相同。本文在实验中发现当青鳉鱼暴露在较高浓度的洋地黄皂苷液中时，立即发生异常行为，无规则四处冲撞，然后身体逐渐失去平衡，出现非自主性下沉，并有假死现象。推测洋地黄皂苷的溶血作用使腮部血细胞破裂溶解，鱼体缺氧，呈现昏厥假死症状。当暴露在较低浓度时，开始未有异常反应，后期出现同样的上述症状，且昏厥假死症状尤为明显。对鱼鳃进行解剖后发现，鳃丝上的毛细血管出现大面积的溶血，红细胞几乎全部破裂溶解，与米氏凯伦藻对鱼鳃的损害特点类似^[7]，提示溶血毒素在鱼毒性藻类对鱼类的致害作用中起主要作用。

目前，对鱼毒性藻类毒性强弱的判断主要是依据其溶血活性的大小，以溶血百分数表示，并以洋地黄皂苷当量表示溶血单位。但鱼毒性藻类损害的主要对象为养殖的鱼类和贝类，溶血单位不够直观，为此本文引入鱼单位(FU)，对鱼单位进行定义并以洋地黄皂苷浓度3.44 μg/mL作为1 FU的当量，建立了半致死时间与暴露浓度间的函数关系。进行赤潮灾害管理时，可通过测定赤潮水体对青鳉鱼的半致死时间，判定其毒性的大小并采取相应的预警方案和应急措施，可有效减少赤潮灾害造成的经济损失。

3   结论

(1) 过氧化氢、洋地黄皂苷对60日龄海洋青鳉鱼1 h的LC₅₀分别是144.5 mmol/L、1.25 μg/mL，过氧化氢与洋地黄皂苷对海洋青鳉鱼的联合致毒作用表现为协同作用。

(2) 本文引入了鱼单位(FU)，为鱼毒性藻类毒性强弱的判定提供更直观的依据，并建立了半致死时间与暴露浓度间的函数关系。本文定义使一条日龄60 d，体重20 mg的海洋青鳉鱼暴露于洋地黄皂苷溶液中0.5 h死亡所需的浓度为1 FU，1FU相当于洋地黄皂苷浓度3.44 μg/mL。